坑人的地理作業
I
誌謝
首先感謝恩師 蔣鎮宇老師從大學到研究所多年來在生活與課業上
無微不至的關照與教誨，特別是每當我疏懶怠惰時也都能給予包容與砥
礪，謝謝您！沒有老師的栽培，我可能無法一窺分子演化的奧妙。我從
老師那裡得到的，不光是生物知識，更重要的是科學研究方法以及對學
術研究的認真態度。
感謝口試委員 陳啟清老師及 吳文鑾老師的撥冗指證，替我為這段
求學歷程一起作見證。
感謝特有生物保育中心 黃朝慶學長在實驗材料採集上的幫助。
論文的完成，是倚靠實驗室所有曾經參與夥伴們的共同努力，其價
值及成果是一起共享的。研究生活的朝夕相處，大家的奮鬥與扶持，所
以我特別要感謝演化實驗室的所有夥伴們，謝謝你們。
最後感謝身在基隆家園的父母與親人，您們無怨的付出我銘記在
心，求學生涯至此，對於過往，我充滿了感激；對於未來，我有無比的
信心，迎向每一次的挑戰。
謹以此篇論文獻給所有關心我的家人、師長及朋友，謝謝你們！ II
中文摘要
本研究藉由偵測葉綠體DNA之atpB及rbcL基因間的非轉譯區間序
列和 RAPD 分子指紋變異來探討大安水蓑衣(Hygrophila pogonocalyx
Hayata)的親緣地理型式，大安水蓑衣根據國際自然及自然資源保育聯盟
(IUCN)之瀕危物種保育等級標準，已可列入嚴重瀕臨絕滅級(critically
endangered)。由於大安水蓑衣主要依靠蜜蜂傳播花粉，其族群間基因交
流可能受限於蟲媒物種的飛行能力，故推測西台灣與宜蘭的族群應具有
地理上的隔離，本實驗共定序出8 個族群 70 個個體葉綠體 DNA之 atpB
及rbcL基因間的非轉譯區間的序列共計849鹼基對，而在 RAPD指紋技
術共計使用50個引子；從RAPD指紋技術資料進行統計分析，在階層性
AMOVA分析中，顯示在地理區間(Φct = 0.934; P = 0.048)，及族群間(Φ
st = 0.945; P < 0.001)皆有明顯的分化，而同一區域的不同族群間分化並不
顯著(Φsc = 0.169; P < 0.001)，利用葉綠體 DNA資料估算族群間的基因交
流值(Nm)和族群間分化指數(Fst)，並將族群間地理距離與基因交流值做
迴歸分析，結果呈現負相關，顯示大安水蓑衣其遺傳分化程度符合
「isolation by distance」 模式(R= 0.745)；根據由葉綠體 DNA所構築的親
緣網狀圖(minimum spanning network)，檢測地理形式與clade間的關係，
顯示大安水蓑衣的東西部兩大地理區所呈現的地理分佈模式，主要是受
到過去棲地破碎化(past fragmentation)的影響，而距今五百萬年前中央山
脈的開始隆起，可能是造成大安水蓑衣地理東西隔離的主因。 III
Abstract
Sequence variation of the atpB-rbcL noncoding spacer region of the chloroplast
DNA and RAPD fingerprints were used to reconstruct the phylogeography of
Hygrophila pogonocalyx. According to the criteria of the International Union for
Conservation of Nature and Nature Resources, H. pogonocalyx is on the Red List
Category due to its endangered status. Entomophilous plants of H. pogonocalyx are
mostly pollinated by honeybees. Gene flow between populations is expected to be
constrained by the migratory capacity of the pollinators. Hierarchical AMOVA
analyses of RAPD fingerprints data, which used 50 random primers, indicated
significant differentiation between geographical regions (Φct = 0.934; P = 0.048),
among populations (Φst = 0.945; P < 0.001), and among populations within region
(Φs c = 0.169; P < 0.001). A total of 849 bp of the cpDNA atpB-rbcL spacer was
sequenced from 8 populations of H. pogonocalyx. Two geographically based groups,
west and east area, were identified by a neighbor-joining tree of cpDNA. Both data
revealed that the distribution of genetic variation followed an "isolation by distance"
model (in cpDNA, R=0.745). Phylogeographic analysis based on the cpDNA
network suggests that the present-day west and east areas of H. pogonocalyx is a
result of past fragmentation. The differentiation between geographic regions may be
ascribed to a long isolation since the formation of the Central Mountain Range five
million years ago. IV
目錄
誌謝………………………………………………………………………… Ⅰ
中文摘要…………………………………………………………………… Ⅱ
英文摘要…………………………………………………………………… Ⅲ
目錄………………………………………………………………………… Ⅳ
表目錄……………………………………………………………………… Ⅵ
圖目錄……………………………………………………………………… Ⅶ
第壹章 緒言……………………………………………… ………………… 1
一、親緣地理的研究……………………………………………………… 1
二、大安水蓑衣的研究歷史回顧………………………………………… 5
三、瀕危物種的保育與其遺傳變異……………………………………… 9
四、分子技術在探討族群結構的應用………………………………… .13
五、研究目的…………………………………………………………… .15
第貳章 材料與方法……………………………………………………… . 16
一、研究材料…………………………………………………………… 16
二、實驗方法………………………… ………………………………… 18
1. RAPD指紋分析……………………………………………………… 18
2.葉綠體DNA的非轉譯區間序列……………………………………… 19
第參章 結果……………………………………………………………… 25
一、 RAPD分子指紋…………………………………………………… 25
二、葉綠體DNA atpB-rbcL noncoding spacer片段…………………… 28
三、大安水蓑衣的親緣地理…… ……………………………………… 30
第肆章 討論………………… …………………………………………… 31
一、大安水蓑衣的遺傳變異…………………………………………… 31
二、大安水蓑衣的族群分化…………………………………………… 32
三、 RAPD指紋技術與葉綠體DNA結果的比較……………………… 34
四、大安水蓑衣的親緣地理模式……………………………………… .37 V
五、大安水蓑衣的保育………………………………………………… 40
第伍章 結論……………………………………………………………… 41
第陸章 參考文獻………………………………………………………… 42
表…………………………………………………………………………… 49
圖…………………………………………………………………………… 58
附錄………………………………………………………………………… 73 VI
表目錄
表一、大安水蓑衣之採樣地點、採集個體數目及族群代號………… 49
表二、進行大安水蓑衣葉綠體DNA介於atpB及rbcL基因
間的noncoding spacer聚合酵素連鎖反應所使用之引
子序列……… ..… .… .……… .… ...……… .… .……… .…… .… ..50
表三、在RAPD指紋技術實驗擁有變異的引子代號及變異
條帶在大安水蓑衣族群間的分佈情形.……… .… .……… .… ..51
表四、根據RAPD資料估算大安水蓑衣族群間及地理區間
的分化程度……… ..… .… .…… .… ...……… .… .……… .…… ...52
表五、根據RAPD資料估算大安水蓑衣族群間基因交流值
和族群間分化指數…………… .… ...……… .… .……… .…… .. 53
表六、根據葉綠體DNA資料估算大安水蓑衣族群haplotype
歧異度、核? 酸歧異度、最小遺傳重組事件及中性測驗.…. 54
表七、根據葉綠體DNA資料所建構樹狀圖中各clade的地理
族群組成… .…… .… ..………… .… ...……… .… .…… .… ..… .....55
表八、根據葉綠體DNA資料估算大安水蓑衣族群間基因交流
值和族群間分化指數…………… .… ...……… .… .……… .… .. 56
表九、估算葉綠體DNA親緣網狀圖各clade的 Dc、Dn值，並
配合檢索表推測在大安水蓑衣不同clade所曾遭受的歷
史事件………… ..……………… .… ...……… .… .……… .…… 57 VII
圖目錄
圖一、大安水蓑衣之全株照片..………………………………… .… .…… . 58
圖二、大安水蓑衣之形態特徵照片..…………………………………… .… 59
圖三、大安水蓑衣之地理分佈圖… .………………………………… .…… .60
圖四、RAPD指紋技術實驗引子129號之電泳照片.……………… .....… 61
圖五、根據RAPD資料以遺傳距離構築之大安水蓑衣族群遺傳
距離樹狀圖………… .……………………………… .… .…… .… .… 62
圖六、根據RAPD資料以UPGMA原理構築之大安水蓑衣演化
樹狀圖……………… .……………………………… .… .…… ..…… 63
圖七、根據RAPD資料以主成份分析法構築的大安水蓑衣立體
空間分佈圖……………… .……………………………… .……… ...64
圖八、大安水蓑衣葉綠體DNA之atpB及rbcL基因間的非轉譯區間在七
個族群的代表序列…… .…… .…… .…… .…… .…… .…………… ...65
圖九、根據葉綠體DNA資料以聚分類分析法構築大安水蓑衣的親
緣樹狀圖…………………………………………… .……………… 69
圖十、根據葉綠體DNA資料構築大安水蓑衣的親緣網狀圖…… ..…… .70
圖十一、大安水蓑衣族群地理距離與利用葉綠體DNA資料估算
的基因交流值之迴歸分析圖……………… ……………… .…… 71
圖十二、西部大安水蓑衣族群地理距離與利用葉綠體DNA資料
估算的基因交流值之迴歸分析圖………………………… ..… .. 72
- 1 -
第壹章 緒言
一、 親緣地理學的研究
親緣地理學(phylogeography)為 Avise et al. (1987)所提出有關歷史性生物地
理學(historical biogeography)的新觀念，其屬於生物地理學(biogeography)的一
支，主要在探討物種演化（親緣）與地質歷史（如冰河、vicariance 事件等）
之間的相關，同時亦區分現今之基因交流及演化歷史事件。與傳統生物地理學
的差異在於後者往往強調較高分類階層的地理分布型式，如有袋類及木蘭目植
物等，所採用的證據除了現今物種的形態特徵及傳播或遷移方式外，化石往往
是不可或缺的直接證據。相對地，親緣地理的研究雖不排除高階分類群的探
討，但主要則是偏重在近緣物種（強調其共同起源的歷史）或種內族群間的研
究。因此親緣地理學的研究被視為是族群遺傳（或稱微演化，microevolution）
及種化之間的橋樑(Moritz and Bermingham, 1998)，其主要的工具係藉由遺傳變
異的偵測及統計分析其空間上分布與地質事件的相關。
親緣地理學的研究是一件相當複雜的工作，必須從多層面切入及探討，始
能一窺究竟；其中遺傳物質變異之研究是重建物種、族群演化歷史及分析遺傳
結構的基礎，而了解遺傳變異在族群的分布，亦可幫助我們在研究瀕危物種時
提供保育訊息，進一步選擇適用的保育策略。近年來新技術的發展，各種不同
的分子標記，包括葉綠體 DNA、細胞核核醣體 DNA、同功酵素基因座對偶基
因以及重複性 DNA 分子片段等，皆是測試遺傳變異的有效工具。
近十年來親緣地理學受到重視而快速發展的原因主要有二：
首先是分析觀念及方法的突破，其次則為分子生物學技術的普遍化。分析
方式的改進影響親緣地理的研究至為顯著，傳統的分歧分類學分析(cladistics)
中，OTU (operation taxonomic unit)僅被置於演化樹的末瑞，因此只可得知單型
(haplotype)間的親緣關係。而 nested clade 分析方式(Templeton, 1998; Excoffier
and Smouse, 1994)則將近緣的 haplotype彼此連接，進一步形成高階的 clades， - 2 -
提供了分子演化及族群親緣研究新的詮釋工具。藉由這樣 haplotype連接所重
建的網狀圖可得到比一般樹狀圖更多的訊息，其中包括可推論物種遷移的路
徑，可能的冰河時期避難所，進一步更可以知道何種haplotype 是屬於較古老
的；這些都是傳統樹狀圖所無法探討的部份。Chiang and Schaal (1999)根據核
DNA internal transcribed spacer 2 (ITS2)之遺傳變異構築之親緣網狀圖
(minimum spanning network)重建塔蘚(Hylocomium splendens)族群間的親緣，顯
現塔蘚植物在北美大陸呈現 isolation by distance 的親緣地理型態；
O’Corry-Crowe et al. (1997)則以此分析方法追蹤白鯨遷移的路徑及雄鯨往外遷
移的生活史；Lu et al. (2001)利用葉綠體DNA haplotype的 network，重建台灣
香杉多起源的演化歷史。而Olsen and Schaal (1999)則利用 nuclear G3pdh gene
的haplotype network 鑑定出樹薯(cassava)的可能起源，樹薯為非洲國家的主要
糧食，利用與野生種基因型的比對重建其親緣地理，顯示樹薯可能起源於亞馬
遜河流域的南部地區。
在分子生物學技術的普遍化包括聚合酵素連鎖反應(PCR)、基因選殖
(cloning)及分子定序技術(sequencing)的成熟，以及許多適用的分子標記被廣泛
利用(Dumolin-Lapègue et al., 1997; Chiang et al., 1999)，其中尤以胞器 DNA因
其母系遺傳和缺乏遺傳重組的特性，被認為最適於用在親緣地理的研究上，如
演化快速的動物粒線體DNA常用於近緣種及族群階層的研究(Bermingham and
Martin, 1998)。相對地，植物的葉綠體或粒線體 DNA則較為保守，在親緣地理
的研究上一直以來被認為有其限制(Schaal et al., 1998)。但是，在最近的研究
中，如學者發現在橡樹及赤楊屬物種具有高度的遺傳變異(Ferris et al., 1995;
Petit et al., 1997; Dumolin-Lapègue et al., 1998)，主要的原因在於這些冰河孓遺
物種古老的演化歷史，擁有更多的機會累積遺傳變異在譜系(lineage)之中。其
中RAPD 指紋技術為另一適用的分子標記，廣泛地被利用來詮釋族群間的基因
交流及分化程度，如 Chou et al. (2000)利用RAPD 指紋技術重建八丈芒
(Miscanthus sinensis var. condensatus)族群在台灣及琉球群島的親緣地理，發現
石桓島在地理距離上雖與台灣較近，但在親緣上則與奄美大島較為近緣，其原 - 3 -
因可能與最後一次冰河時期，原始族群由陸橋藉一次侵入現今的琉球有關。
台灣為一大陸性的島嶼，因此不論在地質歷史及動植物組成上與鄰近大陸
有密不可分的關係，在更新世之前，台灣尚未成形位於亞洲板塊的邊緣，其上
並無高山分布，大約在五百萬年前左右，中央山脈開始隆起形成(Teng, 1990; Liu
et al., 2000)，逐漸造成台灣東西兩大地理區的隔離。而大約在十萬年前，台灣
海峽的陷落，亦使台灣與中國大陸不再相連，但當時因冰河擴張事件，台灣與
中國大陸和現今琉球群島之間，藉由陸橋的連結，物種及族群仍時有交流，避
入所謂的冰河避難所，直至最後一次冰河撤退(大約距今二萬年前)，全球氣溫
顯著回升，海洋水位上升造成島嶼各自獨立，分布各地的族群因而被隔離開
來，並使原先分布於台灣中低海拔的溫帶物種，被迫往高海拔地區或中低海拔
的山頭遷移，形成所謂的孓遺物種，造成台灣植物組成極高的特有度。現生的
台灣植物種類及族群，在過往的地質歷史及近代的生態環境影響之下，其族群
之起源、遺傳組成及造成族群間不同分化程度的原因都是親緣地理學研究的範
疇。
因此親緣地理學成為近年來植物演化研究的主要發展趨勢之一，國際著名
期刊 Molecular Ecology，即於1998 年以專刊的方式(Vo1. 7)，邀請動植物演化
學者如英國的 Harry Smith,美國的John C. Avise, Alan Templeton, Barbara A.
Schaal 等，撰寫論文探討親緣地理的原理及方法；之後，在不同的期刊，以親
緣地理為標題的論文漸成主題，不論在植物或者動物方面皆有許多相關的研究
被發表。
在生物的地理分布上，學者常藉由基因譜系(gene genealogies)的重建，來
追溯近緣物種間或同種植物族群間對偶基因(alleles)的演化關係(Moritz and
Bermingham, 1998; Avise, 2000; Schaal, 2000)，其中有許多演化力量決定此基因
譜系關係，如隨機遺傳漂變(random genetic drift)、天擇(natural selection)、遷移
型式(migration model，包括種子及花粉的傳播)乃至生物本身的族群數量變動
(demography)，過去發生的歷史事件決定族群間基因譜系的關係，更在整個
genealogy中留下痕跡(imprint)，因此藉由族群間遺傳變異的空間分布與地理關 - 4 -
係的了解，更可進一步推估族群間過去所經歷的歷史事件。
而研究遺傳變異（即基因座上之對偶基因頻度）在族群中的空間分布，主
要是以哈溫定律(Hardy-Weinberg equilibrium)為理論基礎，探討造成物種微演化
的可能機制。然而，現存基因是經長期演化的結果及產物，遺傳變異如何在時
間座標上，由前一世代傳遞到下一個世代，成了近年來分子演化學者研究的焦
點，強調親緣關係以及祖先的遺傳多型性如何在隔離的子代族群內從多起源
(polyphyly)經paraphyly達到單一起源(monophyly)的過程，其理論基礎則主要
是依據溯祖理論(coalescent theory) (Hudson, 1990; Futuyma, 1998)。
親緣地理學的研究，除了探討物種演化的歷史與冰河或板塊漂移之間的相
關外，在研究瀕危物種時，更可提供保育工作的基礎。藉由分歧分類學的分析，
了解遺傳變異分布的熱點，其常為冰河避難所，鑑定出可行的經營管理單位
(Moritz, 1994; Chiang, 1998)。 - 5 -
二、大安水蓑衣的研究歷史回顧
大安水蓑衣的分類地位
大安水蓑衣(Hygrophila pogonocalyx Hayata)在分類地位上屬於爵床科
(Acanthaceae)水蓑衣屬(Hygrophila)的台灣特有水生植物(Hsieh and Huang,
1974)，爵床科植物在全世界約有220 屬超過2200 種，主要生長在溫暖地區，
在台灣約有21 屬33 種2 變種；而水蓑衣屬在全世界約有 80 種，主要分布在
熱帶和亞熱帶地區，在台灣產水蓑衣屬中大安水蓑衣為形態較高大的一種。根
據文獻記載，大安水蓑衣為日本籍植物學家早田文藏(Bunzo Hayata)於 1917 年
在台灣中部進行調查植物時發現(Hayata, 1920; Hsieh and Huang, 1974)，並於
1920 年所發表的新種(Hayata, 1920)；其它如水蓑衣(H. lancea)、小獅子草(H.
salicifolia)、柳葉水蓑衣(H. polysperma)據台灣維管束植物簡誌第四卷記載亦為
本屬植物；本屬植物主要特徵為：草本，有時葉腋會長出由托葉或葉柄變成的
刺毛。葉呈披針或倒卵形。花無柄，叢生於葉腋，少有單一；苞片橢圓形或披
針形；小苞葉小或無；花萼管狀，邊緣具五淺裂；花筒偏一邊，膨脹，邊緣成
二唇形，上唇瓣直立，呈二齒狀或淺二裂，下唇瓣呈三深裂，通常為多皺褶之
褶扇形；雄蕊四枚，二長二短；花藥有缺刻，每一花藥由二藥瓣組成；花盤不
明顯；子房長橢圓形；胚珠四個或更多；花柱全緣或具二齒狀。朔果呈長橢圓
形至線形之圓柱狀；花粉塊彎曲堅硬；種子多，其上附有粘毛。
台中縣大安、清水及龍井一帶老農民回憶起三、四十年前沿海地區，大安
水蓑衣嘗為習見之水生植物，尤其在田間溝渠及濕地，數量相當多，但在這一、
二十年來，由於台灣經濟發展快速，沿海土地之利用型式一再轉變，工業區的
設立、港灣、海堤興建、魚塭開發、溝渠整治及水泥化等，皆導致自然環境改
變，嚴重侵害大安水蓑衣生育地，又由於其外貌和一般雜草近似，不易辨識，
因此農民整地時常將它與雜草一起焚毀或放牧牛羊啃食及優勢物種的競爭，如
蘆葦、李氏禾之入侵，由於以上種種的干擾及破壞，導致大安水蓑衣的族群數
量迅速減少。 - 6 -
大安水蓑衣的形態特徵
大安水蓑衣為多年生水生草本植物，其莖方形、直立，節間披密毛 （圖一）。
葉對生、紙質，呈披針形至長橢圓形，長 6~12 cm、寬 2~4 cm，近全緣，葉尖
鈍頭、基部銳形。以掃瞄式電子顯微鏡觀察其上、下表皮，均具有氣孔及多細
胞構成的剛毛，剛毛數目以下表皮較多；另在上、下表皮表面發現扁圓形隆起
球狀體，均勻分布，以下表皮較多，目前對此球狀體構造及生理機制尚不太清
楚。花淡紫色，簇生於葉腋，萼片數枚、卵形或披針形，長 1.0~1.2 cm、寬 3~5
cm，5 裂，裂片線形，著生白剛毛；花冠 2.0~2.5 cm，瓣緣呈二唇形：上唇瓣
直立，長約 1 cm，由二裂片合成；下唇瓣有白柔毛，由三裂片合成，中間裂片
長約 3 mm、寬約 1 mm，長橢圓形，光滑無毛；子房圓錐柱狀，長約 2.5 mm、
寬約 1 mm，光滑無毛。花柱絲狀。蒴果長橢圓形，長約 1 cm。種子略圓扁平
狀，長約 1~2 mm (cf. Wang et al., 2000)，上述特徵可參考（圖二）。
大安水蓑衣的分布
大安水蓑衣目前僅發現在台中縣沿海地區，其生育地多為草澤、溝渠或農
田濕地，生長機質為潮濕土壤環境，惟水的鹽度高於千分之三時則不適宜生
長。分布於大安、龍井及清水鄉鎮，其生育地遭受嚴重破壞，族群數量均極為
稀少，而 1998 年時在宜蘭頭城發現一新族群。
根據調查，估算大安水蓑衣野外植株數目少於 1000株，根據國際自然及
自然資源保育聯盟(IUCN)於1994 年所訂定之瀕危物種保育等級標準，已可列
入嚴重瀕臨絕滅級(critically endangered)，僅次於絕滅級(extinct)及野外絕滅級
(extinct in the wild)若不及時加以保護或復育，必有滅絕之虞。
大安水蓑衣的繁殖
大安水蓑衣的繁殖途徑可分為有性生殖及無性生殖，在有性生殖方面，西
台灣的大安水蓑衣族群（大安、龍井及清水），每年開花期從 9 月至翌年 2 月，
開花盛期時花朵數多，但除了大安鄉塭寮溪口的族群有結實外，其他地點尚無 - 7 -
結實情況，推測應為族群過小而產生自交不稔性之結果。故清水和龍井的族群
均依靠無性生殖以進行繁殖，至於宜蘭頭城的大安水蓑衣族群之開花期為每年
1 至4 月，且產生相當多的果實，屬於有性生殖。
在溫室中，大安水蓑衣種子最適宜的發芽溫度為 20~25℃，在無性繁殖上，
一般採用扦插方式，採插穗長 10~15 cm，以人工介質或河砂，扦插於砂床或穴
盤中，培養於 50% 遮光率之溫室中，約 2~3星期，即可長出不定根，發根率
高達 99% ，發芽速率隨培養環境的相對濕度增加而增加，插穗的年齡，無論
老枝或新枝均可發根存活，只是發根速率有快慢之別。
一般溫室栽培之植株，受溫度及光線的影響，葉子較大且薄，節間較長，
呈現徒長的現象，若移到全日照下則可恢復原來形態；生長過程中發現本種植
物雖喜潮濕地方，且原生育地靠近海邊，離海只有一堤之隔，在生理上究竟屬
於嗜鹽性或耐鹽性尚不太清楚，不過若浸漬在千分之三(含以上)之鹽度，則會
使植株發生枯黑現象。但扦插苗移到一般水池邊或較潮濕的地方栽植，則生長
旺盛，且開花不受影響，但是否可正常授粉形成種子，對其有性生殖生長之影
響尚不了解；由於適應性強，發現靠近水邊植株，長出之側枝，於接近水面處
易形成不定根，若切斷可形成新株。盆栽亦可使其生長，惟遇到乾燥極易立刻
呈現暫時凋萎狀態，澆水可立即使其恢復，若時間過長則呈現永久凋萎(Huang
and Wen, 1999)。
在組織培養上，可以頂芽或頂芽下 1～2 節尚未木質化的節段上之腋芽，
作為培植體，消毒後置入培養基中，作初代培養，放置於 16 小時光週期，25
℃的環境下培養 2 週，即可發現基部形成膨大堅硬的癒合組織，並可從其上形
成不定芽團，芽數眾多，在繼代增殖中，可利用分切芽團或芽團上長出之芽體
進行繼代培養於相同的培養基，增殖的快慢可利用植物生長調節劑的濃度來調
整，但不宜過高。
一般而言，短時間內可獲得大量的植株。利用組織培養技術的優點即可在
有限的空間及短時間內量化繁殖，亦可做為種源離體保存(in vitro conservation)
或與國外進行種源交換(germplasm exchange)研究。大安水蓑衣繁殖一般可採用 - 8 -
扦插法，扦插苗成活後待生長一段時間，可從生長旺盛植株再取插穗，如此循
環取穗扦插，可獲得大量的植株。但利用扦插或組織培養繁殖唯一缺點即所獲
得的植株均為同一營養系，缺乏遺傳上的異質性，若遇到致命的病蟲害，將可
能因族群的同質性，導致全面性的毀滅，因此若採用有性生殖配合無性繁殖將
可降低上述的問題，但如何在現有族群內擴大遺傳歧異度，將是大安水蓑衣在
繁殖時，所面臨的問題之一。 - 9 -
三、瀕危物種的保育與其遺傳變異
保育工作的目的，是希望能藉由人類投入的努力，來挽救因人類行為所導
致的瀕危物種免於滅絕，而最終目標則是在該物種的野外原棲地重建該物種的
族群，並能維持生存、繁衍的活力，這亦是為了保護整個地球生物圈的生物多
樣性(biodiversity)，維持生態系穩定及自然演化歷程的持續進行。另外以人類
利己主義的觀點來看，自然界物種所蘊含的遺傳多樣性，包含許多具有醫藥、
畜牧、農業等潛在價值的天然產物，人類已知的只是冰山一角，尚有更多等待
我們來研究開發。所以物種的絕滅，其意義可能是我們因此而喪失了某些抗
癌、抗AIDS 的藥物、提高某項農作物的產量或抗病能力的基因。例如，天然
抗癌物質紅豆杉醇的發現，人類開始覺醒到原本以為只能做為傢俱的紅豆杉，
在它的組織中卻蘊含了人類醫學無價的寶藏。生物學者相信，類似紅豆杉醇這
樣的天然物，必定也存在於其它的植物，乃至不知名的花草中。這也正是必須
進行保育工作的經濟性理由。
決定這些天然物的出現自然是存在於天然族群個體中的基因，然而這些遺
傳物質，事實上是分子跨越長久的時空演化而來，其中的過程包括了基因突變
(genetic mutation)、天擇(natural selection)並藉由生殖的過程在族群中傳遞下
來；然而在傳遞的過程之中，最殘酷的事實即是基因隨著個體或族群滅絕而消
失，且這樣的反應是永久而不可逆的。換言之，一個基因的終止傳遞在某一個
生物層級之中將是永遠的消失，因此更有必要對於因人為干擾而使族群數量下
降的物種，進行保育。
進行保育工作，一般所想到的是物種的多樣性；挽救瀕絕物種免於滅絕，
正是在保護物種多樣性(species diversity)，而生物多樣性除了物種的層次外，
尚有物種以上生物社會層次的生態系多樣性(ecosystem diversity)及物種以內層
次的遺傳多樣性(genetic diversity)。
高等生物一般為二倍體(diploid)，每一個個體的二倍基因組中擁有分別來
自其父方及母方的單倍基因組，故二倍體生物體內掌管相同功能的基因有兩 - 10 -
個，分別來自其父方及母方，這兩個基因可以有各種不同的變異型式，這些掌
管相同功能的不同變異形式的基因，稱為對偶基因(allele)。當年孟德爾以豌豆
實驗，推導出孟德爾遺傳定律(Mendel’ s laws of inheritance)，其所定義的顯性
(dominant)、隱性(recessive)因子，就是不同的對偶基因。遺傳多樣性，就是由
不同的對偶基因所組合出來的，如血型；舉例來說，每個人體內掌管血型的對
偶基因有兩個，分別來自其父親及母親，它們可能是a, b 或 i 這三種對偶基因
的各種組合，a 及b 為顯性，i為隱性，故 ab 為 AB型，aa 及 ai 為 A 型，bb
及bi為 B型，ii則為O 型。在此例中，掌管血型的對偶基因有三種，但在其
它基因中，則有可能更多，此為物種的種內遺傳多樣性的根本。而上述的ab, ai,
bi組合，稱為異型基因合子(heterozygote)，是由不同的對偶基因掌管此一性狀；
其他 aa, bb, ii 組合，稱為同型基因合子(homozygote)，乃由相同的對偶基因掌
管此一性狀。
顯然地，異型基因合子較同型基因合子更具多樣性，在自然界的實例中，
異型基因合子通常也較具適應度(fitness)，例如在非洲，當地居民的遺傳組成
中，掌控血紅素β (beta)鏈的基因，有一正常顯性對偶基因與一突變的異常隱
性對偶基因，若一個人為兩個正常顯性對偶基因的同型基因合子時，較易染患
瘧疾，這在當地仍是一個普遍的寄生原蟲傳染病；若是帶有兩個異常隱性對偶
基因的同型基因合子，則發生嚴重的鐮刀型貧血症(sickle-cell disease)；而具有
正常與異常對偶基因各一的異型基因合子，既不會發生鐮刀型貧血症，也較不
易染患瘧疾，在當地自然具有較高之適應度。這是屬於在個體層次的遺傳多樣
性。
因此物種以下層次的遺傳多樣性，可分為個體、族群內及族群間三個不同
的層次。而各個對偶基因其異型基因合子比例在個體、族群內及族群間的分布
狀況，稱為遺傳結構(genetic structure)。針對遺傳結構進行的調查研究，就物
種保育而言，是十分重要的；了解遺傳變異的分布更是研擬保育行動計畫、後
續監測及經營管理的依據。若能清楚地了解瀕危物種的遺傳結構，知道其對偶
基因的分布狀況及各族群遺傳多樣性大小，在研擬保育行動計畫時便有所依 - 11 -
據，如應在何處規劃設置保護區及遷地(ex situ)保育、該採集那些種源進行保存
等。
舉例來說，在某些物種其族群間呈現地理上的隔絕狀態（例如一物種分布
在不同島嶼上），根據遺傳結構的調查研究，這些不同島嶼上的不同族群，一
直以來都沒有基因交流，並未有交換遺傳物質的事件發生過，為完全的隔絕狀
態。因此，當保育工作進行監測及經營管理時應要保持這種隔絕狀態，尤其注
意避免人為的引入導致不同島嶼的種源，遭到破壞(MacHugh et al., 1997;
Fleischer et al., 2001)。相反地，某些物種原本的族群因棲地的破壞或碎裂化
(fragmentation)，而分割成數個小族群，根據遺傳結構的調查研究，這些小族群
原本是有基因交流的，但因分割而使基因交流發生隔閡，這種狀況在監測及經
營管理上，便可適時且適度地以人工引入其他族群的種源，使原本的基因交流
得以維持。
然而在進行瀕危物種復育時，不可避免地都會面臨到一個相同的難題，既
然是保育對象，即代表其在原棲地的族群個體數殘存極少，可能已喪失極多遺
傳變異，導致遺傳多樣性(genetic diversity)降低，使其適應環境改變的能力喪
失，滅絕的機會更形增加；其中近緣交配(inbreeding)乃因為在小族群中，不可
避免會有近緣交配的情況發生，所導致的結果是，各對偶基因的頻度不變，但
同型基因合子的比例升高，亦造成遺傳多樣性的喪失，通常異型基因合子較同
型基因合子具遺傳多樣性，也較具適應度(fitness)；另一方面，若隱性致死基因
以同型基因合子狀態出現則導致此個體死亡。
總而言之，同型基因合子比例升高，通常會導致此族群的適應度降低，對
此族群生存與演化是不利的。但在自然界中有許多的植物，其生殖多以近緣交
配的形式完成，尤其是蟲媒物種，如：大安水蓑衣其花粉傳遞主要依靠蜜蜂，
傳遞距離有一定限制，將導致近緣交配的比例升高，尚有某些植物傾向自花授
粉，更是極端的近緣交配，這些偏好近緣交配的物種理論上其族群內的同型基
因合子比例應該偏高，顯示其在演化過程中可能另有其它策略，使近緣交配不
影響其適應度。 - 12 -
另一方面來看，由於瀕危物種每個族群數目均少，當配子逢機配對結合
時，可能造成某些遺傳變異在配對過程中遺失，此種完全依靠機率決定遺傳變
異在演化支系(lineage)能否傳遞下去的演化力量稱為基因漂變(genetic drift)，其
造成族群內所擁有的遺傳變異減少，亦即遺傳多樣性的喪失，而導致基因同質
化，倘若此時棲地發生改變，族群將可能無法適應，而導致全面性的死亡。 - 13 -
四、分子技術在探討族群結構的應用
現代分子遺傳技術的進步(Hillis et al., 1996)，提供了足以幫助釐清生物種
間與種內族群結構的有利工具，分子遺傳的標記(marker)不但可顯現族群內及
族群間遺傳的變異程度，更可用來偵測在演化支系中(lineage)所保存的演化訊
息。
一般而言，物種若呈現廣泛分布的形式，則其在族群間和族群內通常擁有
較高的遺傳歧異度(Hamrick and Godt, 1989)；相對地，瀕危物種可能因其過小
的族群數量，而使得遺傳多樣性喪失(e.g. Saxifraga cernua, Bauert et al., 1998;
Ludwigia ╳ taiwanensis, Peng et al., 1999)。
因此在對瀕危物種採取任何保育措施之前，對於其族群遺傳變異的了解是
必須的，這些基本資訊提供了復育工作成功與否的指標及行動的基礎。分子生
物學技術提供了偵測族群遺傳變異的重要工具，但對於族群過小的物種，其預
期的變異量一般也較低，因此需要較為敏感的分子標記，RAPD分子指紋技術
(Williams et al., 1990; Weising et al., 1995; Michelia and Bova, 1997)，全名 rapid
amplified polymorphic DNA，即為一快速而敏感的檢測遺傳變異工具，其利用
聚合酵素連鎖反應(PCR)原理以DNA聚合酵素(DNA polymerase)藉溫度的循環
複製出DNA 片段，有別於傳統的 PCR 技術中使用專一性極高的一對引子
(primer)及較高的黏合(annealing)溫度（45~60℃，視引子專一性及GC的比率
而定），RAPD分子指紋技術改以專一性低的單一引子，由 10 個任意的鹼基組
合而成，並在較低的溫度下進行黏合，因此具有相當高的敏感性，用於檢測染
色體上的基因座數量，且複製出的DNA 片段多為核DNA，亦可用來評估植物
花粉傳播距離。其敏感的程度可用於區分族群及個體間的差異，常被使用於分
類鑑定、雜交和族群遺傳結構的研究(Le Corre et al., 1997; Aagaard et al., 1998;
Brochmann and Gabrielsen, 1998)，亦有學者使用此技術來重建物種的親緣地理
(Gabrielsen et al., 1997; Tollefsrud et al., 1998)，因此本實驗利用「RAPD指紋技
術」作為前測，來檢測大安水蓑衣個體間的遺傳變異，並進行相關分析。 - 14 -
近年來葉綠體DNA(chloroplast DNA: cpDNA)和細胞核DNA(nuclear DNA:
nrDNA)的分子證據廣為系統分類及族群遺傳學者所利用，進行物種親緣系統
的解析(Dvorak and Zhang, 1992; Mummenhoff, 1995)，其中葉綠體 DNA 於植
物中大多為母系遺傳(Cruzan et al., 1993)，在其遺傳過程中因不經基
因重組，而使得祖先的基因型在經過多次有性生殖後，仍可保存而
被辨識出來(Byrne and Moran, 1994)。故可利用來顯現該物種親本母系來
源及其演化歷史。在過往，大部分學者認為葉綠體 DNA 相當保守，但近來愈
來愈多學者發現近緣種間(Whittmore and Schaal, 1991; Le Corre et al., 1997;
Wolf et al., 1997; Forcioli et al., 1998; King and Ferris, 1998)在某些葉綠體DNA
noncoding region 具有高度的遺傳變異。
而本實驗所選用葉綠體DNA 片段即為介於atpB 及 rbcL 基因間的非轉譯
區間序列(noncoding spacer) (Chiang et al., 1998)，其 non-coding 不受天擇與不經
基因重組的特質，經過長久演化，在族群內自然累積了大量的遺傳變異，可以
用來顯現過去所遭遇的歷史事件(Hillis et al., 1996)，適合用進行親緣地理學的
研究。 - 15 -
五、研究目的
大安水蓑衣為台灣特有的水生植物，近年來其族群數量迅速減少，面臨絕
滅之危機，保育此一瀕危水生植物，除了加強現存族群及生育地的保護工作，
其族群遺傳結構之調查更是進行保育工作時的重要指標。因此本研究之主要目
的，即藉由分子標記之分析來推估大安水蓑衣族群間遺傳分化及基因交流的程
度，調查大安水蓑衣的族群遺傳結構，並可與其他稀有物種比較。進一步重建
大安水蓑衣的親緣地理模式，探討大安水蓑衣可能遭受的歷史事件。最後根據
實驗結果，提供大安水蓑衣可行的保育策略。
- 16 -
第貳章 材料與方法
一、研究材料
1. 野外採集:
進行野外調查及取樣，共計在四個地點，發現僅存的大安水蓑衣族群，
分別為宜蘭頭城(TC)、台中龍井(LC)、台中清水(CS)和台中大安(DA)四地，
其中在龍井再細分為三個族群(LC-1, LC-2, LC-3)，清水亦取得三個族群
(CS-1, CS-2, CS-3)，共取得八個族群，列於表一。
在地理位置上，宜蘭位於台灣東北部而台中位於台灣西部，兩地相距約
140 km，且被中央山脈隔開，而位於台中的三個樣地，清水位於大安和龍井
的中心處，與大安和龍井相距約20 km （見圖三），而位於清水的三個小族群，
彼此相距 5-8.5 km，龍井亦同。
大部分的族群，其族群數量皆小，從 CS-1 的 20 個體左右到DA-1 的 130
個體左右，我們在每個族群採集約族群數量10%的個體，在野外取植物新鮮
的嫩葉組織將其以矽膠乾燥固定，帶回實驗室後保存於-70℃冰箱。
2. DNA萃取:
利用 CTAB的方法(Doyle and Doyle, 1987)進行 total genomic DNA萃取。
其步驟如下：
(1)取保存於-70℃狀態下的葉片組織，置於已加入液態氮之研缽內，研磨至
粉末狀，連同液態氮一起倒入離心管，將管子放置於乾冰上，等液態氮蒸
發以備用。
(2)取離心管內盛 5-10 mg 的植物粉末，加入10 ml 65℃之 3X CTAB與 40 ml
0.4% ß- mercaptoethanol 的混合液，以攪拌匙快速將粉末與緩衝液混合均
勻，置於 65°C 水浴中反應 30 分鐘，在反應過程中每 5~10 分鐘搖晃離心
管一次，使反應完全。 - 17 -
(3)將萃取液倒入離心管中，加入10 ml chloroform / isoamyl alcohol (24:1)，
上下倒轉 50-100 次，充分混合去除脂質及蛋白質。
(4)在室溫下，於桌上型離心機 8,000 rpm，離心 10 分鐘。可將植物殘渣與脂
質、蛋白質，離心至離心管底部。
(5)取上清液至一新的離心管。
(6)重複3-5 步驟，共三次。
(7)加10 ml isopropanol，均勻混合後，置於-20°C冰箱30 分鐘至 24 小時，
使DNA 沉降。
(8)以13,000 rpm 4°C 下，離心 10 分鐘，倒掉上清液，將離心管倒扣於鐵架
上20-30 分鐘，使isopropanol 完全揮發。
(9)將沉降之DNA溶解於 500 ml TE buffer，並轉置於1.5 ml小離心管中，加
入2 ml RNase 放入 37°C水浴作用 30 分鐘，以去除 RNA。
(10)加入500 ml NH4OAc (3M, PH = 7.4)以除去蛋白質。
(11)再加入 500 ml isopropanol。同步驟8，沉降析出 DNA。
(12)以13,000 rpm 4°C下，離心10 分鐘，倒掉上清液。
(13)加入70%酒精，輕彈離心管使沉澱物飄起，再以13000 rpm 4°C 下、離
心2-3 分鐘，將鹽類洗去。
(14)去上清液取沉澱物，倒置於鐵架上10-20 分鐘，等沉澱物內酒精揮發殆
盡。
(15)加入200 ml TE buffer，溶解得genomic DNA。
3. DNA的定量：
利用不同已知濃度的l DNA marker (Promega)，定量所萃取之genomic
DNA，並以TE 溶液將DNA 稀釋為2 ng / ml後，存於-20°C冰箱以備用。 - 18 -
二、實驗方法
實驗分為兩大部分，首先採用 RAPD 指紋技術檢測大安水蓑衣的遺傳變
異；之後定序葉綠體 DNA 介於atpB 及 rbcL 基因間的非轉譯區間序列，進行
相關分析。
1. RAPD指紋分析：
利用UBC商業合成引子 101-150號，複製位於 genomic DNA 上不同的基因
座。RAPD每管共25 ml,包含 6.3 ml DNA (2 ng / ml), 2.5 ml 10X PCR緩衝溶
液、2.5 ml dNTP (8 mM)、濃度 2 pmole 的 primer 0.33 ml、2.5ml MgCl2 (10
mM)、0.5ml的聚合酵素(Taq polymerse, Promega)及 10.37ml的無菌水。並加
入20 ml 礦物油，防止溶液於反應過程中受熱蒸發。其反應條件設為:
(a)92°C，15秒，利用高溫使 DNA 雙股打開(denaturation)。
(b)36°C，20秒，使primer 與模板DNA黏合(annealing)。
(c)72°C，60秒，進行DNA 延伸反應(extension)。
(d)重覆進行(a)-(c)步驟35 個循環。
(e)72°C 作用 10 分鐘後，保存於4°C。
RAPD產物在 2%之 NuSieve 3:1瓊膠(FMC Bio Products)上電泳後，以
ethidium bromide染色，並以Polaroid 667底片感光，並選用的合適Size marker
(Bio100 DNA Ladder of 100bp- 3kbp, PROtech)作為標準，判斷片段大小。
後依據照片上條帶的有無將其紀錄成表，其中 1 表有條帶，0 表無條帶。
RAPD DATA 分析：
A.族群遺傳分析
(1)先利用 AMOVA-PREP 軟體(version 1.01; Miller, 1998)將條帶紀錄表轉換
成資料矩陣，而後使用AMOVA versus 1.55 (Excoffier, 1993)軟體，測試
族群間及地理區間的分化程度，計算出ΦCT、ΦST、ΦSC值，其中ΦCT - 19 -
為地理區間的分化程度，ΦST為族群間的分化程度，ΦSC為為地理區內
族群間的分化程度。
(2)以Tfpga 1.3 (Miller, 1997)軟體計算族群間的遺傳距離(genetic
distance)，並構築族群的樹狀圖。
(3)以 DnaSP 3.0 (Rozas and Rozas, 1999)軟體計算族群間分化程度指數(Fst)
及族群間基因交流值(Nm)。
B.UPGMA樹狀圖
(1)以TREECON version 1.3b (Van de Peer, 1997)套裝軟體進行分析利用
UPGMA (unweighted pair-group method using arithmetic averages)原理構
築出演化樹狀圖。
(2)利用重複選取的原理，進行 bootstrap 1000 次分析(Felsenstein, 1985)，測
驗樹狀圖分群之可信度，依據 Hillis and Bull (1993)以電腦亂數分析，若
bootstrap 數值大於70%則往往具大於 95%的可信度。
C.主成份分析法
根據 Nei and Li (1979)所提出的公式：Sxy = 2 mxy / (mx + my)來估算兩兩個
體間的相似指數(similarity index)，其中mxy表示個體 x 和個體 y在 RAPD
指紋技術中共同擁有的條帶，使用 NTSYS-PC (version 1.8, Rohlf, 1993)套
裝軟體進行主成份分析，可得到一立體空間分布圖來顯示大安水蓑衣個體
間的關連。
2. 葉綠體DNA的非轉譯區間序列：
A.PCR (Polymerase Chain Reaction)
利用萬用引子(universal primer)（表二）增值擴大葉綠體 DNA 介於 atpB及
rbcL 基因間的 noncoding spacer (Chiang et al., 1998)，以 Taq polymerase 在
溫度循環器上複製所欲片段。在總體積100 ml的反應液中加入 0.5 ml聚合
酵素(Taq polymerase)，10 ml 10X PCR 緩衝溶液，10 ml 的 dNTP (8 mM)，濃
度2 pmole的Primers各10 ml ，10 ml的MgCl2 (10 mM) ，最後加入10 ml DNA - 20 -
(2 ng / ml)，並以無菌水補足 100 ml。反應在溫度循環機進行，共進行31 個
循環，每個循環流程為：92°C，45 秒，將 DNA 的雙股變性打開
(denaturation)；53°C，1 分15 秒，使 DNA與引子結合(annealing)；72°C，
1 分30秒，進行 DNA延伸反應(extension)；最後在 72°C 作用 10 分鐘，反
應完成後，溫度循環機維持在 4°C。取 5 ml的 PCR 產物加上 1 ml 6倍的染
色溶液，在1%瓊酯凝膠(agarose gel)中以 100伏特電壓跑電泳約30 分鐘，
經過溴化乙啶螢光染劑(EtBr)處理後，配合所選用的DNA ladder當標幟
(Bio100 DNA Ladder of 100bp- 3kbp, PROtech)，在紫外線燈台下拍照。
B.純化
DNA 聚合酵素反應(PCR)的產物有時所含的片段並不只有一段，而且有許
多離子、dNTP、引子存在，所以必須經過純化。當 PCR 產物不只一段或
不乾淨時，先把所得的PCR 產物放在1%瓊酯凝膠，以 1X TAE的緩衝液，
以70 伏特電壓進行電泳 30 分鐘，經溴化乙啶螢光染劑染色後，在紫外光
燈台下將含有所要DNA 的膠切下，以 Agarose Gel DNA Extraction Kit
(Viogene)純化。
C.T-A cloning
(1)DNA 分子的連接(ligation)
將純化後之PCR產物，取2 ml置於 200 ml eppendorf 加 5 ml 2x ligation
buffer，1 ml ATP，1 ml T4 DNA ligase 及 1 ml載體 DNA (pGEM®
-T Easy
Vector DNA) (Promega, Cat. #A1360)，在 4℃水浴中反應 16 小時，使 PCR
產物連結至載體上。
(2)轉型作用(transformation)
a.製備勝任細胞(competent cell)
從培養12 至16 小時之大腸桿菌菌液中，吸取 500 ml至含30 ml LB的錐
形瓶中，於37°C shaker 培養2 小時。隨後取出 25 ml菌液加入預先冷卻的 - 21 -
離心管中，於4°C下以4,000 rpm離心10 分鐘，倒掉上清液，再加入 20 ml
4°C的50 mM CaCl2 solution，輕搖至沉澱菌種溶解，冰浴 30 分鐘以上，
使大腸桿菌活化、沉澱。之後再於 4°C下以4,000 rpm離心10 分鐘，倒掉
上清液，再加入 4 ml CaCl2 solution，輕搖至沉澱菌種溶解，並置於 4°C冰
浴中，以備進行質體轉殖用。
b.轉型作用(transformation)
取200 ml已活化之菌液加入 5 ml與 PCR 產物連接好之載體溶液，均勻混
合後冰浴 40分鐘，接著放入 42℃水浴，進行 heat shock 1 分 30 秒後，迅
速投入冰水中，使載體進入大腸桿菌中並待塗碟用。
c.塗碟
取出含有 ampicillin (50 mg / ml)的 LB平板培養基，塗上20 ml X-gal (50 mg
/ ml)與5 ml IPTG (100 mM)，靜置30 分鐘待藥品吸收，將經過轉型之勝任
細胞以100 ml / plate 的量均勻塗抹於 LB agar 表面，待菌液乾後，置於 37
℃培養 12 至16 小時。
D.萃取質體DNA(plasmid DNA)
a.養菌
將經過培養並呈白色的菌落轉接到含 50 mg/ml ampicillin 之 5 ml LB溶液
中，於37℃培養12 至16 小時，以備抽取質體 DNA。
b.萃取質體DNA
取2 ml 培養 12 至16 小時之菌液，5,000 rpm離心 5 分鐘後，倒棄上層液，
加入 100 ml預冷之 solutionⅠ(50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 10
mM EDTA) ，震盪後靜置室溫5分鐘。接著加200 ml solutionⅡ(0.2 N NaOH,
1% SDS)，上下翻轉並置於冰上5 分鐘，加入 150 ml冷卻的 solutionⅢ(3 M
KOAc, pH 4.8)，混合後冰浴 5 分鐘，接著以13,000 rpm離心5 分鐘，吸取
上清液加入800 ml 95%酒精，混合後靜置 5 分鐘，以 13,000 rpm離心 5 分
鐘，倒棄酒精並風乾後，加入 50 ml RNase / TE buffer (10 mg/ml)，輕拍混 - 22 -
合後保存於-20℃。
E.DNA 定序
DNA 定序是以雙去氧核甘鏈停止法(dideoxynucleotide chain termination,
Sanger et al., 1977)以³ ² P-dATP做標記，定序出cpDNA 位於 atpB-rbcL 基因
間的 noncoding spacer。依據 PCR的反應原理進行反應，共進行 29 個循環，
每個循環流程為：95°C，30秒，將 DNA 的雙股變性打開(denaturation)；
57°C，30 秒，使DNA與引子結合(annealing)；70°C，1 分，進行DNA 延
伸反應(extension)；所有循環完成後，加入3 ml stop solution 停止反應。反
應後的產物在 6%的polyacrylamide-8M urea gel 上進行電泳分析，完成後將
膠轉附在 3M濾紙上，再將膠片烘乾，用 X-ray film 感光 48-72 小時後，沖
片，判讀 DNA 序列。
核酸序列自動定序由成功大學醫院病理部暨病理研究中心完成
(ABI PRISMTM 337 DNA Sequencer, Perkin-Elmer; ABI BigDye Terminator
Cycle Sequencing Kit, Perkin-Elmer)
F.DNA 序列分析(Sequence analysis)與親緣分析(phylogenetic analysis)
a.將定序所得 DNA序列輸入電腦，DNA 分子序列的資料以 Clustal X 1.81 程
式(Thompson et al., 1997)完成比對及排列(alignment)後，加以人工手動調
整。利用網際網路將所得大安水蓑衣 DNA序列上傳至 GCG (Genetics
computer Group, Version 10.0, Madison, Wisconsin)基因資料庫中，以 FASTA
程式進行比對搜尋，確定定序所得序列是 Chloroplast DNA atpB-rbcL 基因
間的noncoding spacer片段。
b.使用 MEGA 2.0 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 2.0)
(Kumar et al. 2001)套裝軟體比較彼此間鹼基對替換(transition；兩個嘌呤或
嘧啶間的突變，A/G 或T/C突變)及鹼基對顛換(transversion；嘌呤與嘧啶間
的突變，T.C/A.G突變)的發生頻率及比值，來計算大安水蓑衣序列彼此的 - 23 -
變化，並計算出全部基對取代數目(K, total nucleotide substitutions)，即每個
位置的鹼基對替換及鹼基對顛換的發生頻率。
c.利用 DnaSP version 3.0 (Rozas and Rozas, 1999)計算族群內、族群間及地理
區間的遺傳歧異度(genetic diversity)，以 haplotype diversity (h) (Nei and
Tajima, 1983)和nucleotide diversity (?)來量化顯示族群的遺傳歧異度。
d.使用TREECON v1.3b (Van de Peer, 1997)套裝軟體以 Kimura (1980)雙參數
模式(two-parameter model)的方法計算鹼基替代率及遺傳距離軟體進行分
析，利用聚類分析法(neighbor- joining method)原理(Saitou and Nei, 1987)構
築出大安水蓑衣所有個體的演化樹狀圖。NJ tree 中每一個 group之可信度
利用不加權重、重複一千次的 bootstrap (Felsenstein, 1985)分析檢測；
bootstrap 數值大於0.7相當於統計學上95%信心水準支持(Hillis and Bull,
1993)。同時亦利用 MEGA v2.0 (Kumar et al., 2001)軟體計算兩兩比較
(pairwise comparison) DNA 各單型(haplotype)間的突變數，所得數據以
MINSPNET 軟體(Excoffier and Smouse, 1994)建構親緣網狀圖 minimum
spanning network (Excoffier et al., 1992)，藉以追溯 haplotypes間的親緣關係
與演化歷史。
e.最小遺傳重組事件(minimum recombination events)、中性測驗(neutrality test)
及評估族群間及地理區間的基因交流(Nm)程度，均利用 DnaSP Version 3.0
(Rozas and Rozas, 1999)進行運算；其中Nm值表示每個世代族群間遷徙個
體數，此值可用來間接評估基因交流的大小(Slatkin, 1985)。若 Nm值等於
1，表示在地區性族群間每一個世代，有一個個體交流，足以防止藉由個別
族群因基因漂變所產生的遺傳分化。因此，當 Nm 值大於 1，即代表族群間
會有較強基因交流。也根據FST = 1 / (1 + 2Nm)的公式，估計遺傳分化程度，
其中N表示族群中有效族群量，m 表示個體遷徙速率。FST是族群間遺傳分
化指數，主要是判斷族群間遺傳分化(genetic differentiation)的情形，若 FST
﹤0.05，則代表族群間幾乎沒有遺傳分化，若 0.05﹤FST ﹤0.15，則表示族
群間的分化程度低等，若0.15﹤FST ﹤0.25，代表族群間屬中度分化，若 - 24 -
FST ﹥0.25時，表示族群間分化程度非常高(Wright, 1978)。同時，測試 Nm
值與地理距離間的相關，用以測驗是否符合Isolation by distance之模式，
並以 SAS統計程式中之F test 測試其可信度。最後以D* statistic測試分子
序列是呈現中性(Fu and Li, 1993)。
f.利用軟體Geo-Dis (Posada et al., 2000.)檢測 minimum spanning network 中地
理形式與 clade (或haplotype)間的關係，其主要運算出：clade distance (Dc
值)與nested-clade distance (Dn 值)，其中Dc 值表示一clade 內地理分布的
距離，而 Dn 值表示一clade 與上一階層(next higher level)地理分布中心的
距離。將 Dc、Dn 值配合檢索表(Templeton et al., 1995)推估族群間過去所經
歷的歷史事件。 - 25 -
第參章 結果
一、RAPD分子指紋
在實驗中共使用 50 個引子，並利用 PCR 原理隨機放大基因座間片段，所
採用的引子中有 15 個引子（表三）顯現出個體間的遺傳變異，根據電泳後照
片結果（如：圖四）將基因座(locus)的有無轉換成 1 與 0，其中1 表 locus 的存
在，0 表此locus不存在以，結果共得 158 個在不同個體間具變異的電泳條帶
（表三）。從條帶的分布情形，約略可看出大安水蓑衣個體被分為三群，採集
自宜蘭頭城的個體明顯自成一群，在台中大安的個體也群聚為一群，但清水和
龍井的個體則無法分辨，至於宜蘭頭城的個體則擁有較多的變異，與西台灣的
族群差異頗大。
根據條帶記錄表，先以AMOVA-PREP軟體轉換成資料矩陣後，利用
AMOVA 軟體分析，得到階層性的Φ值（表四），在地理區間ΦCT = 0.934 (P =
0.048)，在族群間ΦST = 0.945 (P < 0.001)，在同一地理區內的不同族群間ΦSC =
0.169 (P < 0.001)；而在各個族群間的ΦST值，宜蘭頭城和西台灣的大安水蓑衣
族群分化程度ΦST值大約在 0.97 (P < 0.001)，即宜蘭頭城和西台灣的大安水蓑
衣族群已有高度分化，若再繼續分析西台灣的族群，在清水、龍井在兩個地點
的族群，其分化程度介於 0.001~0.66，差距頗大，表示某些族群間有分化但不
明顯，至於大安的族群與其它西部族群分化程度ΦST值介於0.80~0.84，和宜蘭
頭城一樣為擁有高度分化的一群，而所有族群間的分化程度ΦST = 0.945 (P <
0.001)，故整體來說在大安水蓑衣的族群間，確實存在著高度分化。
同時利用 TFPGA軟體計算各族群間的遺傳距離(genetic distance)，若值越
大表示兩族群擁有較多的遺傳變異；並根據遺傳距離，以族群為單位構築遺傳
距離樹狀圖（圖五），在圖中宜蘭頭城的族群一開始便獨立出來，且擁有極大
的遺傳距離，更進一步顯現宜蘭頭城族群和西台灣族群間擁有明顯的遺傳分
化。 - 26 -
以DnaSP 軟體計算族群間遺傳分化指數(Fst)及基因交流值(Nm)，得到表
五，其中 Nm 值公式為Fst = 1 / (1 + 4Nm)，表示在一個世代內，兩族群間有多
少個體能夠交換遺傳物質。就大安水蓑衣而言，即在一個世代間，兩族群間能
有多少個體能將花粉傳播給另一個族群，當 Nm值 ≧ 1，即足以防止個別族
群因基因漂變所產生的遺傳分化。根據表五，宜蘭頭城的族群與西部族群間
Nm 值甚小，均在 0.01左右，而 Fst值從0.96 到 0.97，顯示頭城與其他族群具
有高度的遺傳分化，而在西台灣的大安族群其與龍井、清水族群間遺傳分化亦
相當顯著，也擁有較低的 Nm 值(0.04-0.07)和較高的 Fst值(0.77-0.87)，但在清
水和龍井兩地之間出現例外，兩族群擁有較高的 Nm 值(0.13-2.44)（最高的 Nm
值：2.44，出現在 CS-1 和LC-2 兩族群間）和較低的 Fst值(0.11-0.66)，顯示在
清水和龍井的族群間尚可能存有基因交流。
以TREECON v1.3b 軟體進行分析，利用其中 UPGMA (unweighted
pair-group method using arithmetic averages)原理構築出演化樹狀圖（圖六），在
演化樹狀圖中可明顯地看出所有的大安水蓑衣個體按照東台灣和西台灣二大
地理區分群，其中西台灣這個大群又可再分為大安和清水+龍井這兩小群，每
個分群均依照棲地分布 ，但在清水 、龍井兩地間有交雜的現象，CS-1-02, CS-2-01,
CS-2-02, CS-2-03 和CS-2-04與龍井族群的個體，分布在同一個支系中，顯示
清水、龍井棲地間的某些個體，其遺傳組成可能頗為相似，導致在演化樹狀圖
中被歸為一群，相對於清水、龍井個體在支系中交雜的現象，東西兩大地理支
系，個體各自成群，且分支長度(branch length)頗長，顯示東西兩大地理支系其
個體在遺傳組成上可能已有明顯差異；而在演化樹狀圖中，每個分支上所出現
的數字為 bootstrap 數值，其以重複選取的原理，進行bootstrap 1000 次分析，
測驗演化樹狀圖之分群的可信度，若 bootstrap 數值大於 70%，則表示此分枝
往往具有大於 95%的可信度，一開始分群的支系（頭城、大安、清水＋龍井這
三個支系）都擁有極高bootstrap數值(100%)，表示其分群的可信度相當高。
使用 NTSYS-PC套裝軟體其根據Nei and Li (1979)所提出的公式：Sxy = 2
mxy / (mx + my)其中mxy表示個體x和個體y在RAPD指紋技術中共同擁有的條 - 27 -
帶，來估算兩兩個體間的相似指數(similarity index)進行主成份分析，得到一立
體空間分布圖（圖七）可顯示大安水蓑衣個體間的關連，立體空間分布圖所得
結果和UPGMA 演化樹狀圖相似，一樣可見到頭城、大安、清水＋龍井的分群
型式，從立體空間分布圖尚發現在頭城族群間內的個體彼此距離較遠，不像大
安或清水＋龍井來地緊密，這表示在頭城其族群可能比大安或清水＋龍井的族
群擁有更多的族群內遺傳變異。 - 28 -
二.葉綠體 DNA atpB-rbcL noncoding spacer片段
利用atpB-1 和rbcL-1 引子(Chiang et al., 1998)（表二）可以成功地以 PCR
技術擴增大安水蓑衣葉綠體 DNA 介於 atpB及 rbcL 基因間的noncoding spacer
片段，實驗共完成東部及西部八個族群 70 個樣本，其序列長度介於
817-830 鹼基對，將所得序列上傳至GCG 基因資料庫中，利用 FASTA 程式
進行比對搜尋，確認定序所得序列均為葉綠體 DNA atpB-rbcL 基因間的
noncoding spacer 片段；並使用軟體 Clustal X 將序列兩兩相互比對排列
(alignment)後，完成 DNA 序列之矩陣，共有 52 個變異位置(6.1%)，
其中只有 4 個變異(0.47%)具有親緣系統訊息。圖八為大安水蓑衣各族
群葉綠體 DNA 之atpB及rbcL 基因間的非轉譯區間的代表序列。
在大安水蓑衣所有個體之葉綠體DNA位於atpB及rbcL基因間非轉譯區
間序列的核? 酸平均組成為：腺嘌呤(A: adenine)佔 36.4%，胸腺嘧啶
(T: thymine)佔 32.8%，鳥糞嘌呤(G: guanine)佔 14.4%，胞嘧啶(C:
cytosine)佔 16.4%；顯示此段序列是以 A、T 為主要組成(AT-rich)，
佔所有鹼基組成約 70%。MEGA 軟體也同時比較各序列間鹼基對替
換(transition)及鹼基對顛換(transversion)發生的比值，結果顯示大安
水蓑衣族群間 transition / transversion 的平均值為 1.1，此值大於 Li
(1997)所提出之期望值 0.5，顯示此段基因仍在持續演化中。
利用 DnaSP 程式進行各族群之核? 酸歧異度(nucleotide
diversity, ?)的計算(表六)。所有個體的核? 酸歧異度(?)為 0.00343 ±
0.00041，而頭城族群的核? 酸歧異度(?)為 0.00647 ± 0.00128 大於西部
族群的核? 酸歧異度(?) 0.00237 ± 0.00031。在 70 個樣本中，共發現
33 個 haplotypes，其中 haplotype 8 出現在 24 個體分屬龍井、清水和
大安族群，為最大的 haplotype (34.3%)，在西部族群的 60 個個體共
有 24 個 haplotypes，而在宜蘭頭城的 10 個個體中分屬 9 個
haplotypes，具有頗高的歧異度 haplotype diversity (h)：0.978 ± 0.054 - 29 -
大於西部族群的 haplotype diversity (h)：0.827 ± 0.046，從表六可確認
宜蘭頭城其族群內遺傳變異大於西部族群，這與利用 RAPD 指紋技術
得到的立體空間分布圖所推論之結果相似，而在西部的七個族群，
以大安族群擁有最高的核? 酸歧異度(0.00263 ± 0.00039)和 haplotype
diversity (0.911 ± 0.054)。
使用 TREECON v1.3b軟體進行分析計算大安水蓑衣葉綠體 DNA
atpB-rbcL noncoding spacer 序列的變異，並以 Kimura (1980)雙參數模
式計算出遺傳距離，根據此一遺傳距離利用聚類分析法(neighbor
joining method)建構出親緣演化樹狀圖（圖九）。在樹狀圖中，以宜
蘭頭城其中一個體做為外群(outgroup)，可將大安水蓑衣明顯地分為
東西地理區兩大群，與 RAPD 資料利用UPGMA原理構築的演化樹狀圖
大致上相似，但原本呈現單一群聚(monophyly)的大安族群，在
cpDNA 資料所構築的親緣演化樹狀圖，分散在清水、龍井的族群中，
也就聚在一起，但並未顯現地理族群各自群聚的型式；在樹狀圖右
側顯示 2-1~2-6, 3-1 和3-2 表示為各個不同階層的 clade，將各 clade 所包含
的個體數與分布族群整理成表七，而在圖三中各大安水蓑衣棲地旁的圓餅
圖，則表示各地點其 clade 的組成比例。
以DnaSP 軟體計算族群間的遺傳分化指數(Fst)及基因交流值(Nm)，得到表
八，與利用RAPD 資料所估算的結果有類似的型式，宜蘭頭城的族群與西部
的族群其 Nm 值甚小從0.29 到0.52，而 Fst值從 0.49到 0.63，顯示頭城與其他
地點具有高度的遺傳分化，而在西台灣的龍井、清水、大安族群間，除 CS-1
族群與其他族群有顯著分化(Fst值從 0.30-0.63)，可能是因為其樣本數過小，只
有2 個樣本導致。因此扣除 CS-1 族群後，在西台灣各族群間遺傳分化則不顯
著，其Nm 值從 5.74-121.17 而 Fst值從0.004-0.10，顯示西台灣的族群清水、
龍井和大安間可能存有基因交流。 - 30 -
三、大安水蓑衣的親緣地理
利用 MEGA v2.0 軟體，比較(pairwise comparison)大安水蓑衣葉綠
體 DNA 各單型(haplotype)間的突變數，再使用 MINSPENT 軟體(Excoffer
and Smouse,1994)分析，將近緣的 haplotype彼此連接，進一步形成高階的
clades，構築出親緣網狀圖 minimum spanning network（圖十），藉以追溯各
haplotype 間的親緣關係與演化歷史，來重建大安水蓑衣的親緣地理型式。
其依據兩項原則來探討最有可能的演化路徑：一、新的 haplotype 是從古老
的haplotype衍生而來。二、若缺乏基因交流，則新突變會被侷限在原有的族
群內。配合中性學派的論點，認為在 nested clade 圖中內部的clades (interior
clades)比尖端的 clades (tip clades)較為古老；因此檢視圖十位於親緣網狀圖中
心位置的 haplotype 6 及haplotype 18 可能為大安水蓑衣葉綠體 DNA 中較為古
老的 haplotype。
從大安水蓑衣的親緣網狀圖，發現宜蘭頭城族群的 haplotypes 各自相連，
形成 clade 3-2 = {[2-5 = (1-11 + 1-12)] + [2-6 = (1-13 + 1-14)]}，且在clade 3-2 中
並未發現任何西部族群的 haplotypes，顯示宜蘭頭城族群與西部族群可能長時
間缺乏基因交流，使得東部和西部的族群因突變而形成的新haplotype 被侷限
在各自的族群內。
西部族群的haplotypes相連所形成的 clade 3-1 = {[2-1 = (1-1 + 1-2 + 1-3 +
1-4)] + [2-2 = (1-5 + 1-6)] + [ 2-3 = (1-7 + 1-8)] + [2-4 = (1-9 + 1-10)] }無法與地
理分布呈現相關，即龍井、清水、大安族群並未像頭城族群形成單一族群群聚
的現象，而是散佈在的西部各個clade 中，可參照表七，了解各clade 的族群組
成；亦即表示在大安、清水、龍井各族群所形成的新haplotype，可能因族群間
的基因交流而出現在各個族群。 - 31 -
第肆章 討論
一、大安水蓑衣的遺傳變異
在大安水蓑衣葉綠體 DNA atpB-rbcL noncoding spacer片段，所有個體
的核? 酸歧異度為 0.00343 ± 0.00041，haplotype diversi ty (h) = 0.870
± 0.036 與其他瀕危物種比較，如：香杉(Cunninghamia konishii) (Lu et al., 2001)
其葉綠體 DNA ? 酸歧異度為 0.01018 ± 0.00263 及台東蘇鐵(Cycas
taitungensis) (Huang et al., 2001)其葉綠體DNA ? 酸歧異度為 0.01268 ±
0.07749，haplotype diversity (h) = 0.998 ± 0.002，可以看出大安水蓑衣明
顯低於其他瀕危物
誌謝
首先感謝恩師 蔣鎮宇老師從大學到研究所多年來在生活與課業上
無微不至的關照與教誨，特別是每當我疏懶怠惰時也都能給予包容與砥
礪，謝謝您！沒有老師的栽培，我可能無法一窺分子演化的奧妙。我從
老師那裡得到的，不光是生物知識，更重要的是科學研究方法以及對學
術研究的認真態度。
感謝口試委員 陳啟清老師及 吳文鑾老師的撥冗指證，替我為這段
求學歷程一起作見證。
感謝特有生物保育中心 黃朝慶學長在實驗材料採集上的幫助。
論文的完成，是倚靠實驗室所有曾經參與夥伴們的共同努力，其價
值及成果是一起共享的。研究生活的朝夕相處，大家的奮鬥與扶持，所
以我特別要感謝演化實驗室的所有夥伴們，謝謝你們。
最後感謝身在基隆家園的父母與親人，您們無怨的付出我銘記在
心，求學生涯至此，對於過往，我充滿了感激；對於未來，我有無比的
信心，迎向每一次的挑戰。
謹以此篇論文獻給所有關心我的家人、師長及朋友，謝謝你們！ II
中文摘要
本研究藉由偵測葉綠體DNA之atpB及rbcL基因間的非轉譯區間序
列和 RAPD 分子指紋變異來探討大安水蓑衣(Hygrophila pogonocalyx
Hayata)的親緣地理型式，大安水蓑衣根據國際自然及自然資源保育聯盟
(IUCN)之瀕危物種保育等級標準，已可列入嚴重瀕臨絕滅級(critically
endangered)。由於大安水蓑衣主要依靠蜜蜂傳播花粉，其族群間基因交
流可能受限於蟲媒物種的飛行能力，故推測西台灣與宜蘭的族群應具有
地理上的隔離，本實驗共定序出8 個族群 70 個個體葉綠體 DNA之 atpB
及rbcL基因間的非轉譯區間的序列共計849鹼基對，而在 RAPD指紋技
術共計使用50個引子；從RAPD指紋技術資料進行統計分析，在階層性
AMOVA分析中，顯示在地理區間(Φct = 0.934; P = 0.048)，及族群間(Φ
st = 0.945; P < 0.001)皆有明顯的分化，而同一區域的不同族群間分化並不
顯著(Φsc = 0.169; P < 0.001)，利用葉綠體 DNA資料估算族群間的基因交
流值(Nm)和族群間分化指數(Fst)，並將族群間地理距離與基因交流值做
迴歸分析，結果呈現負相關，顯示大安水蓑衣其遺傳分化程度符合
「isolation by distance」 模式(R= 0.745)；根據由葉綠體 DNA所構築的親
緣網狀圖(minimum spanning network)，檢測地理形式與clade間的關係，
顯示大安水蓑衣的東西部兩大地理區所呈現的地理分佈模式，主要是受
到過去棲地破碎化(past fragmentation)的影響，而距今五百萬年前中央山
脈的開始隆起，可能是造成大安水蓑衣地理東西隔離的主因。 III
Abstract
Sequence variation of the atpB-rbcL noncoding spacer region of the chloroplast
DNA and RAPD fingerprints were used to reconstruct the phylogeography of
Hygrophila pogonocalyx. According to the criteria of the International Union for
Conservation of Nature and Nature Resources, H. pogonocalyx is on the Red List
Category due to its endangered status. Entomophilous plants of H. pogonocalyx are
mostly pollinated by honeybees. Gene flow between populations is expected to be
constrained by the migratory capacity of the pollinators. Hierarchical AMOVA
analyses of RAPD fingerprints data, which used 50 random primers, indicated
significant differentiation between geographical regions (Φct = 0.934; P = 0.048),
among populations (Φst = 0.945; P < 0.001), and among populations within region
(Φs c = 0.169; P < 0.001). A total of 849 bp of the cpDNA atpB-rbcL spacer was
sequenced from 8 populations of H. pogonocalyx. Two geographically based groups,
west and east area, were identified by a neighbor-joining tree of cpDNA. Both data
revealed that the distribution of genetic variation followed an "isolation by distance"
model (in cpDNA, R=0.745). Phylogeographic analysis based on the cpDNA
network suggests that the present-day west and east areas of H. pogonocalyx is a
result of past fragmentation. The differentiation between geographic regions may be
ascribed to a long isolation since the formation of the Central Mountain Range five
million years ago. IV
目錄
誌謝………………………………………………………………………… Ⅰ
中文摘要…………………………………………………………………… Ⅱ
英文摘要…………………………………………………………………… Ⅲ
目錄………………………………………………………………………… Ⅳ
表目錄……………………………………………………………………… Ⅵ
圖目錄……………………………………………………………………… Ⅶ
第壹章 緒言……………………………………………… ………………… 1
一、親緣地理的研究……………………………………………………… 1
二、大安水蓑衣的研究歷史回顧………………………………………… 5
三、瀕危物種的保育與其遺傳變異……………………………………… 9
四、分子技術在探討族群結構的應用………………………………… .13
五、研究目的…………………………………………………………… .15
第貳章 材料與方法……………………………………………………… . 16
一、研究材料…………………………………………………………… 16
二、實驗方法………………………… ………………………………… 18
1. RAPD指紋分析……………………………………………………… 18
2.葉綠體DNA的非轉譯區間序列……………………………………… 19
第參章 結果……………………………………………………………… 25
一、 RAPD分子指紋…………………………………………………… 25
二、葉綠體DNA atpB-rbcL noncoding spacer片段…………………… 28
三、大安水蓑衣的親緣地理…… ……………………………………… 30
第肆章 討論………………… …………………………………………… 31
一、大安水蓑衣的遺傳變異…………………………………………… 31
二、大安水蓑衣的族群分化…………………………………………… 32
三、 RAPD指紋技術與葉綠體DNA結果的比較……………………… 34
四、大安水蓑衣的親緣地理模式……………………………………… .37 V
五、大安水蓑衣的保育………………………………………………… 40
第伍章 結論……………………………………………………………… 41
第陸章 參考文獻………………………………………………………… 42
表…………………………………………………………………………… 49
圖…………………………………………………………………………… 58
附錄………………………………………………………………………… 73 VI
表目錄
表一、大安水蓑衣之採樣地點、採集個體數目及族群代號………… 49
表二、進行大安水蓑衣葉綠體DNA介於atpB及rbcL基因
間的noncoding spacer聚合酵素連鎖反應所使用之引
子序列……… ..… .… .……… .… ...……… .… .……… .…… .… ..50
表三、在RAPD指紋技術實驗擁有變異的引子代號及變異
條帶在大安水蓑衣族群間的分佈情形.……… .… .……… .… ..51
表四、根據RAPD資料估算大安水蓑衣族群間及地理區間
的分化程度……… ..… .… .…… .… ...……… .… .……… .…… ...52
表五、根據RAPD資料估算大安水蓑衣族群間基因交流值
和族群間分化指數…………… .… ...……… .… .……… .…… .. 53
表六、根據葉綠體DNA資料估算大安水蓑衣族群haplotype
歧異度、核? 酸歧異度、最小遺傳重組事件及中性測驗.…. 54
表七、根據葉綠體DNA資料所建構樹狀圖中各clade的地理
族群組成… .…… .… ..………… .… ...……… .… .…… .… ..… .....55
表八、根據葉綠體DNA資料估算大安水蓑衣族群間基因交流
值和族群間分化指數…………… .… ...……… .… .……… .… .. 56
表九、估算葉綠體DNA親緣網狀圖各clade的 Dc、Dn值，並
配合檢索表推測在大安水蓑衣不同clade所曾遭受的歷
史事件………… ..……………… .… ...……… .… .……… .…… 57 VII
圖目錄
圖一、大安水蓑衣之全株照片..………………………………… .… .…… . 58
圖二、大安水蓑衣之形態特徵照片..…………………………………… .… 59
圖三、大安水蓑衣之地理分佈圖… .………………………………… .…… .60
圖四、RAPD指紋技術實驗引子129號之電泳照片.……………… .....… 61
圖五、根據RAPD資料以遺傳距離構築之大安水蓑衣族群遺傳
距離樹狀圖………… .……………………………… .… .…… .… .… 62
圖六、根據RAPD資料以UPGMA原理構築之大安水蓑衣演化
樹狀圖……………… .……………………………… .… .…… ..…… 63
圖七、根據RAPD資料以主成份分析法構築的大安水蓑衣立體
空間分佈圖……………… .……………………………… .……… ...64
圖八、大安水蓑衣葉綠體DNA之atpB及rbcL基因間的非轉譯區間在七
個族群的代表序列…… .…… .…… .…… .…… .…… .…………… ...65
圖九、根據葉綠體DNA資料以聚分類分析法構築大安水蓑衣的親
緣樹狀圖…………………………………………… .……………… 69
圖十、根據葉綠體DNA資料構築大安水蓑衣的親緣網狀圖…… ..…… .70
圖十一、大安水蓑衣族群地理距離與利用葉綠體DNA資料估算
的基因交流值之迴歸分析圖……………… ……………… .…… 71
圖十二、西部大安水蓑衣族群地理距離與利用葉綠體DNA資料
估算的基因交流值之迴歸分析圖………………………… ..… .. 72
- 1 -
第壹章 緒言
一、 親緣地理學的研究
親緣地理學(phylogeography)為 Avise et al. (1987)所提出有關歷史性生物地
理學(historical biogeography)的新觀念，其屬於生物地理學(biogeography)的一
支，主要在探討物種演化（親緣）與地質歷史（如冰河、vicariance 事件等）
之間的相關，同時亦區分現今之基因交流及演化歷史事件。與傳統生物地理學
的差異在於後者往往強調較高分類階層的地理分布型式，如有袋類及木蘭目植
物等，所採用的證據除了現今物種的形態特徵及傳播或遷移方式外，化石往往
是不可或缺的直接證據。相對地，親緣地理的研究雖不排除高階分類群的探
討，但主要則是偏重在近緣物種（強調其共同起源的歷史）或種內族群間的研
究。因此親緣地理學的研究被視為是族群遺傳（或稱微演化，microevolution）
及種化之間的橋樑(Moritz and Bermingham, 1998)，其主要的工具係藉由遺傳變
異的偵測及統計分析其空間上分布與地質事件的相關。
親緣地理學的研究是一件相當複雜的工作，必須從多層面切入及探討，始
能一窺究竟；其中遺傳物質變異之研究是重建物種、族群演化歷史及分析遺傳
結構的基礎，而了解遺傳變異在族群的分布，亦可幫助我們在研究瀕危物種時
提供保育訊息，進一步選擇適用的保育策略。近年來新技術的發展，各種不同
的分子標記，包括葉綠體 DNA、細胞核核醣體 DNA、同功酵素基因座對偶基
因以及重複性 DNA 分子片段等，皆是測試遺傳變異的有效工具。
近十年來親緣地理學受到重視而快速發展的原因主要有二：
首先是分析觀念及方法的突破，其次則為分子生物學技術的普遍化。分析
方式的改進影響親緣地理的研究至為顯著，傳統的分歧分類學分析(cladistics)
中，OTU (operation taxonomic unit)僅被置於演化樹的末瑞，因此只可得知單型
(haplotype)間的親緣關係。而 nested clade 分析方式(Templeton, 1998; Excoffier
and Smouse, 1994)則將近緣的 haplotype彼此連接，進一步形成高階的 clades， - 2 -
提供了分子演化及族群親緣研究新的詮釋工具。藉由這樣 haplotype連接所重
建的網狀圖可得到比一般樹狀圖更多的訊息，其中包括可推論物種遷移的路
徑，可能的冰河時期避難所，進一步更可以知道何種haplotype 是屬於較古老
的；這些都是傳統樹狀圖所無法探討的部份。Chiang and Schaal (1999)根據核
DNA internal transcribed spacer 2 (ITS2)之遺傳變異構築之親緣網狀圖
(minimum spanning network)重建塔蘚(Hylocomium splendens)族群間的親緣，顯
現塔蘚植物在北美大陸呈現 isolation by distance 的親緣地理型態；
O’Corry-Crowe et al. (1997)則以此分析方法追蹤白鯨遷移的路徑及雄鯨往外遷
移的生活史；Lu et al. (2001)利用葉綠體DNA haplotype的 network，重建台灣
香杉多起源的演化歷史。而Olsen and Schaal (1999)則利用 nuclear G3pdh gene
的haplotype network 鑑定出樹薯(cassava)的可能起源，樹薯為非洲國家的主要
糧食，利用與野生種基因型的比對重建其親緣地理，顯示樹薯可能起源於亞馬
遜河流域的南部地區。
在分子生物學技術的普遍化包括聚合酵素連鎖反應(PCR)、基因選殖
(cloning)及分子定序技術(sequencing)的成熟，以及許多適用的分子標記被廣泛
利用(Dumolin-Lapègue et al., 1997; Chiang et al., 1999)，其中尤以胞器 DNA因
其母系遺傳和缺乏遺傳重組的特性，被認為最適於用在親緣地理的研究上，如
演化快速的動物粒線體DNA常用於近緣種及族群階層的研究(Bermingham and
Martin, 1998)。相對地，植物的葉綠體或粒線體 DNA則較為保守，在親緣地理
的研究上一直以來被認為有其限制(Schaal et al., 1998)。但是，在最近的研究
中，如學者發現在橡樹及赤楊屬物種具有高度的遺傳變異(Ferris et al., 1995;
Petit et al., 1997; Dumolin-Lapègue et al., 1998)，主要的原因在於這些冰河孓遺
物種古老的演化歷史，擁有更多的機會累積遺傳變異在譜系(lineage)之中。其
中RAPD 指紋技術為另一適用的分子標記，廣泛地被利用來詮釋族群間的基因
交流及分化程度，如 Chou et al. (2000)利用RAPD 指紋技術重建八丈芒
(Miscanthus sinensis var. condensatus)族群在台灣及琉球群島的親緣地理，發現
石桓島在地理距離上雖與台灣較近，但在親緣上則與奄美大島較為近緣，其原 - 3 -
因可能與最後一次冰河時期，原始族群由陸橋藉一次侵入現今的琉球有關。
台灣為一大陸性的島嶼，因此不論在地質歷史及動植物組成上與鄰近大陸
有密不可分的關係，在更新世之前，台灣尚未成形位於亞洲板塊的邊緣，其上
並無高山分布，大約在五百萬年前左右，中央山脈開始隆起形成(Teng, 1990; Liu
et al., 2000)，逐漸造成台灣東西兩大地理區的隔離。而大約在十萬年前，台灣
海峽的陷落，亦使台灣與中國大陸不再相連，但當時因冰河擴張事件，台灣與
中國大陸和現今琉球群島之間，藉由陸橋的連結，物種及族群仍時有交流，避
入所謂的冰河避難所，直至最後一次冰河撤退(大約距今二萬年前)，全球氣溫
顯著回升，海洋水位上升造成島嶼各自獨立，分布各地的族群因而被隔離開
來，並使原先分布於台灣中低海拔的溫帶物種，被迫往高海拔地區或中低海拔
的山頭遷移，形成所謂的孓遺物種，造成台灣植物組成極高的特有度。現生的
台灣植物種類及族群，在過往的地質歷史及近代的生態環境影響之下，其族群
之起源、遺傳組成及造成族群間不同分化程度的原因都是親緣地理學研究的範
疇。
因此親緣地理學成為近年來植物演化研究的主要發展趨勢之一，國際著名
期刊 Molecular Ecology，即於1998 年以專刊的方式(Vo1. 7)，邀請動植物演化
學者如英國的 Harry Smith,美國的John C. Avise, Alan Templeton, Barbara A.
Schaal 等，撰寫論文探討親緣地理的原理及方法；之後，在不同的期刊，以親
緣地理為標題的論文漸成主題，不論在植物或者動物方面皆有許多相關的研究
被發表。
在生物的地理分布上，學者常藉由基因譜系(gene genealogies)的重建，來
追溯近緣物種間或同種植物族群間對偶基因(alleles)的演化關係(Moritz and
Bermingham, 1998; Avise, 2000; Schaal, 2000)，其中有許多演化力量決定此基因
譜系關係，如隨機遺傳漂變(random genetic drift)、天擇(natural selection)、遷移
型式(migration model，包括種子及花粉的傳播)乃至生物本身的族群數量變動
(demography)，過去發生的歷史事件決定族群間基因譜系的關係，更在整個
genealogy中留下痕跡(imprint)，因此藉由族群間遺傳變異的空間分布與地理關 - 4 -
係的了解，更可進一步推估族群間過去所經歷的歷史事件。
而研究遺傳變異（即基因座上之對偶基因頻度）在族群中的空間分布，主
要是以哈溫定律(Hardy-Weinberg equilibrium)為理論基礎，探討造成物種微演化
的可能機制。然而，現存基因是經長期演化的結果及產物，遺傳變異如何在時
間座標上，由前一世代傳遞到下一個世代，成了近年來分子演化學者研究的焦
點，強調親緣關係以及祖先的遺傳多型性如何在隔離的子代族群內從多起源
(polyphyly)經paraphyly達到單一起源(monophyly)的過程，其理論基礎則主要
是依據溯祖理論(coalescent theory) (Hudson, 1990; Futuyma, 1998)。
親緣地理學的研究，除了探討物種演化的歷史與冰河或板塊漂移之間的相
關外，在研究瀕危物種時，更可提供保育工作的基礎。藉由分歧分類學的分析，
了解遺傳變異分布的熱點，其常為冰河避難所，鑑定出可行的經營管理單位
(Moritz, 1994; Chiang, 1998)。 - 5 -
二、大安水蓑衣的研究歷史回顧
大安水蓑衣的分類地位
大安水蓑衣(Hygrophila pogonocalyx Hayata)在分類地位上屬於爵床科
(Acanthaceae)水蓑衣屬(Hygrophila)的台灣特有水生植物(Hsieh and Huang,
1974)，爵床科植物在全世界約有220 屬超過2200 種，主要生長在溫暖地區，
在台灣約有21 屬33 種2 變種；而水蓑衣屬在全世界約有 80 種，主要分布在
熱帶和亞熱帶地區，在台灣產水蓑衣屬中大安水蓑衣為形態較高大的一種。根
據文獻記載，大安水蓑衣為日本籍植物學家早田文藏(Bunzo Hayata)於 1917 年
在台灣中部進行調查植物時發現(Hayata, 1920; Hsieh and Huang, 1974)，並於
1920 年所發表的新種(Hayata, 1920)；其它如水蓑衣(H. lancea)、小獅子草(H.
salicifolia)、柳葉水蓑衣(H. polysperma)據台灣維管束植物簡誌第四卷記載亦為
本屬植物；本屬植物主要特徵為：草本，有時葉腋會長出由托葉或葉柄變成的
刺毛。葉呈披針或倒卵形。花無柄，叢生於葉腋，少有單一；苞片橢圓形或披
針形；小苞葉小或無；花萼管狀，邊緣具五淺裂；花筒偏一邊，膨脹，邊緣成
二唇形，上唇瓣直立，呈二齒狀或淺二裂，下唇瓣呈三深裂，通常為多皺褶之
褶扇形；雄蕊四枚，二長二短；花藥有缺刻，每一花藥由二藥瓣組成；花盤不
明顯；子房長橢圓形；胚珠四個或更多；花柱全緣或具二齒狀。朔果呈長橢圓
形至線形之圓柱狀；花粉塊彎曲堅硬；種子多，其上附有粘毛。
台中縣大安、清水及龍井一帶老農民回憶起三、四十年前沿海地區，大安
水蓑衣嘗為習見之水生植物，尤其在田間溝渠及濕地，數量相當多，但在這一、
二十年來，由於台灣經濟發展快速，沿海土地之利用型式一再轉變，工業區的
設立、港灣、海堤興建、魚塭開發、溝渠整治及水泥化等，皆導致自然環境改
變，嚴重侵害大安水蓑衣生育地，又由於其外貌和一般雜草近似，不易辨識，
因此農民整地時常將它與雜草一起焚毀或放牧牛羊啃食及優勢物種的競爭，如
蘆葦、李氏禾之入侵，由於以上種種的干擾及破壞，導致大安水蓑衣的族群數
量迅速減少。 - 6 -
大安水蓑衣的形態特徵
大安水蓑衣為多年生水生草本植物，其莖方形、直立，節間披密毛 （圖一）。
葉對生、紙質，呈披針形至長橢圓形，長 6~12 cm、寬 2~4 cm，近全緣，葉尖
鈍頭、基部銳形。以掃瞄式電子顯微鏡觀察其上、下表皮，均具有氣孔及多細
胞構成的剛毛，剛毛數目以下表皮較多；另在上、下表皮表面發現扁圓形隆起
球狀體，均勻分布，以下表皮較多，目前對此球狀體構造及生理機制尚不太清
楚。花淡紫色，簇生於葉腋，萼片數枚、卵形或披針形，長 1.0~1.2 cm、寬 3~5
cm，5 裂，裂片線形，著生白剛毛；花冠 2.0~2.5 cm，瓣緣呈二唇形：上唇瓣
直立，長約 1 cm，由二裂片合成；下唇瓣有白柔毛，由三裂片合成，中間裂片
長約 3 mm、寬約 1 mm，長橢圓形，光滑無毛；子房圓錐柱狀，長約 2.5 mm、
寬約 1 mm，光滑無毛。花柱絲狀。蒴果長橢圓形，長約 1 cm。種子略圓扁平
狀，長約 1~2 mm (cf. Wang et al., 2000)，上述特徵可參考（圖二）。
大安水蓑衣的分布
大安水蓑衣目前僅發現在台中縣沿海地區，其生育地多為草澤、溝渠或農
田濕地，生長機質為潮濕土壤環境，惟水的鹽度高於千分之三時則不適宜生
長。分布於大安、龍井及清水鄉鎮，其生育地遭受嚴重破壞，族群數量均極為
稀少，而 1998 年時在宜蘭頭城發現一新族群。
根據調查，估算大安水蓑衣野外植株數目少於 1000株，根據國際自然及
自然資源保育聯盟(IUCN)於1994 年所訂定之瀕危物種保育等級標準，已可列
入嚴重瀕臨絕滅級(critically endangered)，僅次於絕滅級(extinct)及野外絕滅級
(extinct in the wild)若不及時加以保護或復育，必有滅絕之虞。
大安水蓑衣的繁殖
大安水蓑衣的繁殖途徑可分為有性生殖及無性生殖，在有性生殖方面，西
台灣的大安水蓑衣族群（大安、龍井及清水），每年開花期從 9 月至翌年 2 月，
開花盛期時花朵數多，但除了大安鄉塭寮溪口的族群有結實外，其他地點尚無 - 7 -
結實情況，推測應為族群過小而產生自交不稔性之結果。故清水和龍井的族群
均依靠無性生殖以進行繁殖，至於宜蘭頭城的大安水蓑衣族群之開花期為每年
1 至4 月，且產生相當多的果實，屬於有性生殖。
在溫室中，大安水蓑衣種子最適宜的發芽溫度為 20~25℃，在無性繁殖上，
一般採用扦插方式，採插穗長 10~15 cm，以人工介質或河砂，扦插於砂床或穴
盤中，培養於 50% 遮光率之溫室中，約 2~3星期，即可長出不定根，發根率
高達 99% ，發芽速率隨培養環境的相對濕度增加而增加，插穗的年齡，無論
老枝或新枝均可發根存活，只是發根速率有快慢之別。
一般溫室栽培之植株，受溫度及光線的影響，葉子較大且薄，節間較長，
呈現徒長的現象，若移到全日照下則可恢復原來形態；生長過程中發現本種植
物雖喜潮濕地方，且原生育地靠近海邊，離海只有一堤之隔，在生理上究竟屬
於嗜鹽性或耐鹽性尚不太清楚，不過若浸漬在千分之三(含以上)之鹽度，則會
使植株發生枯黑現象。但扦插苗移到一般水池邊或較潮濕的地方栽植，則生長
旺盛，且開花不受影響，但是否可正常授粉形成種子，對其有性生殖生長之影
響尚不了解；由於適應性強，發現靠近水邊植株，長出之側枝，於接近水面處
易形成不定根，若切斷可形成新株。盆栽亦可使其生長，惟遇到乾燥極易立刻
呈現暫時凋萎狀態，澆水可立即使其恢復，若時間過長則呈現永久凋萎(Huang
and Wen, 1999)。
在組織培養上，可以頂芽或頂芽下 1～2 節尚未木質化的節段上之腋芽，
作為培植體，消毒後置入培養基中，作初代培養，放置於 16 小時光週期，25
℃的環境下培養 2 週，即可發現基部形成膨大堅硬的癒合組織，並可從其上形
成不定芽團，芽數眾多，在繼代增殖中，可利用分切芽團或芽團上長出之芽體
進行繼代培養於相同的培養基，增殖的快慢可利用植物生長調節劑的濃度來調
整，但不宜過高。
一般而言，短時間內可獲得大量的植株。利用組織培養技術的優點即可在
有限的空間及短時間內量化繁殖，亦可做為種源離體保存(in vitro conservation)
或與國外進行種源交換(germplasm exchange)研究。大安水蓑衣繁殖一般可採用 - 8 -
扦插法，扦插苗成活後待生長一段時間，可從生長旺盛植株再取插穗，如此循
環取穗扦插，可獲得大量的植株。但利用扦插或組織培養繁殖唯一缺點即所獲
得的植株均為同一營養系，缺乏遺傳上的異質性，若遇到致命的病蟲害，將可
能因族群的同質性，導致全面性的毀滅，因此若採用有性生殖配合無性繁殖將
可降低上述的問題，但如何在現有族群內擴大遺傳歧異度，將是大安水蓑衣在
繁殖時，所面臨的問題之一。 - 9 -
三、瀕危物種的保育與其遺傳變異
保育工作的目的，是希望能藉由人類投入的努力，來挽救因人類行為所導
致的瀕危物種免於滅絕，而最終目標則是在該物種的野外原棲地重建該物種的
族群，並能維持生存、繁衍的活力，這亦是為了保護整個地球生物圈的生物多
樣性(biodiversity)，維持生態系穩定及自然演化歷程的持續進行。另外以人類
利己主義的觀點來看，自然界物種所蘊含的遺傳多樣性，包含許多具有醫藥、
畜牧、農業等潛在價值的天然產物，人類已知的只是冰山一角，尚有更多等待
我們來研究開發。所以物種的絕滅，其意義可能是我們因此而喪失了某些抗
癌、抗AIDS 的藥物、提高某項農作物的產量或抗病能力的基因。例如，天然
抗癌物質紅豆杉醇的發現，人類開始覺醒到原本以為只能做為傢俱的紅豆杉，
在它的組織中卻蘊含了人類醫學無價的寶藏。生物學者相信，類似紅豆杉醇這
樣的天然物，必定也存在於其它的植物，乃至不知名的花草中。這也正是必須
進行保育工作的經濟性理由。
決定這些天然物的出現自然是存在於天然族群個體中的基因，然而這些遺
傳物質，事實上是分子跨越長久的時空演化而來，其中的過程包括了基因突變
(genetic mutation)、天擇(natural selection)並藉由生殖的過程在族群中傳遞下
來；然而在傳遞的過程之中，最殘酷的事實即是基因隨著個體或族群滅絕而消
失，且這樣的反應是永久而不可逆的。換言之，一個基因的終止傳遞在某一個
生物層級之中將是永遠的消失，因此更有必要對於因人為干擾而使族群數量下
降的物種，進行保育。
進行保育工作，一般所想到的是物種的多樣性；挽救瀕絕物種免於滅絕，
正是在保護物種多樣性(species diversity)，而生物多樣性除了物種的層次外，
尚有物種以上生物社會層次的生態系多樣性(ecosystem diversity)及物種以內層
次的遺傳多樣性(genetic diversity)。
高等生物一般為二倍體(diploid)，每一個個體的二倍基因組中擁有分別來
自其父方及母方的單倍基因組，故二倍體生物體內掌管相同功能的基因有兩 - 10 -
個，分別來自其父方及母方，這兩個基因可以有各種不同的變異型式，這些掌
管相同功能的不同變異形式的基因，稱為對偶基因(allele)。當年孟德爾以豌豆
實驗，推導出孟德爾遺傳定律(Mendel’ s laws of inheritance)，其所定義的顯性
(dominant)、隱性(recessive)因子，就是不同的對偶基因。遺傳多樣性，就是由
不同的對偶基因所組合出來的，如血型；舉例來說，每個人體內掌管血型的對
偶基因有兩個，分別來自其父親及母親，它們可能是a, b 或 i 這三種對偶基因
的各種組合，a 及b 為顯性，i為隱性，故 ab 為 AB型，aa 及 ai 為 A 型，bb
及bi為 B型，ii則為O 型。在此例中，掌管血型的對偶基因有三種，但在其
它基因中，則有可能更多，此為物種的種內遺傳多樣性的根本。而上述的ab, ai,
bi組合，稱為異型基因合子(heterozygote)，是由不同的對偶基因掌管此一性狀；
其他 aa, bb, ii 組合，稱為同型基因合子(homozygote)，乃由相同的對偶基因掌
管此一性狀。
顯然地，異型基因合子較同型基因合子更具多樣性，在自然界的實例中，
異型基因合子通常也較具適應度(fitness)，例如在非洲，當地居民的遺傳組成
中，掌控血紅素β (beta)鏈的基因，有一正常顯性對偶基因與一突變的異常隱
性對偶基因，若一個人為兩個正常顯性對偶基因的同型基因合子時，較易染患
瘧疾，這在當地仍是一個普遍的寄生原蟲傳染病；若是帶有兩個異常隱性對偶
基因的同型基因合子，則發生嚴重的鐮刀型貧血症(sickle-cell disease)；而具有
正常與異常對偶基因各一的異型基因合子，既不會發生鐮刀型貧血症，也較不
易染患瘧疾，在當地自然具有較高之適應度。這是屬於在個體層次的遺傳多樣
性。
因此物種以下層次的遺傳多樣性，可分為個體、族群內及族群間三個不同
的層次。而各個對偶基因其異型基因合子比例在個體、族群內及族群間的分布
狀況，稱為遺傳結構(genetic structure)。針對遺傳結構進行的調查研究，就物
種保育而言，是十分重要的；了解遺傳變異的分布更是研擬保育行動計畫、後
續監測及經營管理的依據。若能清楚地了解瀕危物種的遺傳結構，知道其對偶
基因的分布狀況及各族群遺傳多樣性大小，在研擬保育行動計畫時便有所依 - 11 -
據，如應在何處規劃設置保護區及遷地(ex situ)保育、該採集那些種源進行保存
等。
舉例來說，在某些物種其族群間呈現地理上的隔絕狀態（例如一物種分布
在不同島嶼上），根據遺傳結構的調查研究，這些不同島嶼上的不同族群，一
直以來都沒有基因交流，並未有交換遺傳物質的事件發生過，為完全的隔絕狀
態。因此，當保育工作進行監測及經營管理時應要保持這種隔絕狀態，尤其注
意避免人為的引入導致不同島嶼的種源，遭到破壞(MacHugh et al., 1997;
Fleischer et al., 2001)。相反地，某些物種原本的族群因棲地的破壞或碎裂化
(fragmentation)，而分割成數個小族群，根據遺傳結構的調查研究，這些小族群
原本是有基因交流的，但因分割而使基因交流發生隔閡，這種狀況在監測及經
營管理上，便可適時且適度地以人工引入其他族群的種源，使原本的基因交流
得以維持。
然而在進行瀕危物種復育時，不可避免地都會面臨到一個相同的難題，既
然是保育對象，即代表其在原棲地的族群個體數殘存極少，可能已喪失極多遺
傳變異，導致遺傳多樣性(genetic diversity)降低，使其適應環境改變的能力喪
失，滅絕的機會更形增加；其中近緣交配(inbreeding)乃因為在小族群中，不可
避免會有近緣交配的情況發生，所導致的結果是，各對偶基因的頻度不變，但
同型基因合子的比例升高，亦造成遺傳多樣性的喪失，通常異型基因合子較同
型基因合子具遺傳多樣性，也較具適應度(fitness)；另一方面，若隱性致死基因
以同型基因合子狀態出現則導致此個體死亡。
總而言之，同型基因合子比例升高，通常會導致此族群的適應度降低，對
此族群生存與演化是不利的。但在自然界中有許多的植物，其生殖多以近緣交
配的形式完成，尤其是蟲媒物種，如：大安水蓑衣其花粉傳遞主要依靠蜜蜂，
傳遞距離有一定限制，將導致近緣交配的比例升高，尚有某些植物傾向自花授
粉，更是極端的近緣交配，這些偏好近緣交配的物種理論上其族群內的同型基
因合子比例應該偏高，顯示其在演化過程中可能另有其它策略，使近緣交配不
影響其適應度。 - 12 -
另一方面來看，由於瀕危物種每個族群數目均少，當配子逢機配對結合
時，可能造成某些遺傳變異在配對過程中遺失，此種完全依靠機率決定遺傳變
異在演化支系(lineage)能否傳遞下去的演化力量稱為基因漂變(genetic drift)，其
造成族群內所擁有的遺傳變異減少，亦即遺傳多樣性的喪失，而導致基因同質
化，倘若此時棲地發生改變，族群將可能無法適應，而導致全面性的死亡。 - 13 -
四、分子技術在探討族群結構的應用
現代分子遺傳技術的進步(Hillis et al., 1996)，提供了足以幫助釐清生物種
間與種內族群結構的有利工具，分子遺傳的標記(marker)不但可顯現族群內及
族群間遺傳的變異程度，更可用來偵測在演化支系中(lineage)所保存的演化訊
息。
一般而言，物種若呈現廣泛分布的形式，則其在族群間和族群內通常擁有
較高的遺傳歧異度(Hamrick and Godt, 1989)；相對地，瀕危物種可能因其過小
的族群數量，而使得遺傳多樣性喪失(e.g. Saxifraga cernua, Bauert et al., 1998;
Ludwigia ╳ taiwanensis, Peng et al., 1999)。
因此在對瀕危物種採取任何保育措施之前，對於其族群遺傳變異的了解是
必須的，這些基本資訊提供了復育工作成功與否的指標及行動的基礎。分子生
物學技術提供了偵測族群遺傳變異的重要工具，但對於族群過小的物種，其預
期的變異量一般也較低，因此需要較為敏感的分子標記，RAPD分子指紋技術
(Williams et al., 1990; Weising et al., 1995; Michelia and Bova, 1997)，全名 rapid
amplified polymorphic DNA，即為一快速而敏感的檢測遺傳變異工具，其利用
聚合酵素連鎖反應(PCR)原理以DNA聚合酵素(DNA polymerase)藉溫度的循環
複製出DNA 片段，有別於傳統的 PCR 技術中使用專一性極高的一對引子
(primer)及較高的黏合(annealing)溫度（45~60℃，視引子專一性及GC的比率
而定），RAPD分子指紋技術改以專一性低的單一引子，由 10 個任意的鹼基組
合而成，並在較低的溫度下進行黏合，因此具有相當高的敏感性，用於檢測染
色體上的基因座數量，且複製出的DNA 片段多為核DNA，亦可用來評估植物
花粉傳播距離。其敏感的程度可用於區分族群及個體間的差異，常被使用於分
類鑑定、雜交和族群遺傳結構的研究(Le Corre et al., 1997; Aagaard et al., 1998;
Brochmann and Gabrielsen, 1998)，亦有學者使用此技術來重建物種的親緣地理
(Gabrielsen et al., 1997; Tollefsrud et al., 1998)，因此本實驗利用「RAPD指紋技
術」作為前測，來檢測大安水蓑衣個體間的遺傳變異，並進行相關分析。 - 14 -
近年來葉綠體DNA(chloroplast DNA: cpDNA)和細胞核DNA(nuclear DNA:
nrDNA)的分子證據廣為系統分類及族群遺傳學者所利用，進行物種親緣系統
的解析(Dvorak and Zhang, 1992; Mummenhoff, 1995)，其中葉綠體 DNA 於植
物中大多為母系遺傳(Cruzan et al., 1993)，在其遺傳過程中因不經基
因重組，而使得祖先的基因型在經過多次有性生殖後，仍可保存而
被辨識出來(Byrne and Moran, 1994)。故可利用來顯現該物種親本母系來
源及其演化歷史。在過往，大部分學者認為葉綠體 DNA 相當保守，但近來愈
來愈多學者發現近緣種間(Whittmore and Schaal, 1991; Le Corre et al., 1997;
Wolf et al., 1997; Forcioli et al., 1998; King and Ferris, 1998)在某些葉綠體DNA
noncoding region 具有高度的遺傳變異。
而本實驗所選用葉綠體DNA 片段即為介於atpB 及 rbcL 基因間的非轉譯
區間序列(noncoding spacer) (Chiang et al., 1998)，其 non-coding 不受天擇與不經
基因重組的特質，經過長久演化，在族群內自然累積了大量的遺傳變異，可以
用來顯現過去所遭遇的歷史事件(Hillis et al., 1996)，適合用進行親緣地理學的
研究。 - 15 -
五、研究目的
大安水蓑衣為台灣特有的水生植物，近年來其族群數量迅速減少，面臨絕
滅之危機，保育此一瀕危水生植物，除了加強現存族群及生育地的保護工作，
其族群遺傳結構之調查更是進行保育工作時的重要指標。因此本研究之主要目
的，即藉由分子標記之分析來推估大安水蓑衣族群間遺傳分化及基因交流的程
度，調查大安水蓑衣的族群遺傳結構，並可與其他稀有物種比較。進一步重建
大安水蓑衣的親緣地理模式，探討大安水蓑衣可能遭受的歷史事件。最後根據
實驗結果，提供大安水蓑衣可行的保育策略。
- 16 -
第貳章 材料與方法
一、研究材料
1. 野外採集:
進行野外調查及取樣，共計在四個地點，發現僅存的大安水蓑衣族群，
分別為宜蘭頭城(TC)、台中龍井(LC)、台中清水(CS)和台中大安(DA)四地，
其中在龍井再細分為三個族群(LC-1, LC-2, LC-3)，清水亦取得三個族群
(CS-1, CS-2, CS-3)，共取得八個族群，列於表一。
在地理位置上，宜蘭位於台灣東北部而台中位於台灣西部，兩地相距約
140 km，且被中央山脈隔開，而位於台中的三個樣地，清水位於大安和龍井
的中心處，與大安和龍井相距約20 km （見圖三），而位於清水的三個小族群，
彼此相距 5-8.5 km，龍井亦同。
大部分的族群，其族群數量皆小，從 CS-1 的 20 個體左右到DA-1 的 130
個體左右，我們在每個族群採集約族群數量10%的個體，在野外取植物新鮮
的嫩葉組織將其以矽膠乾燥固定，帶回實驗室後保存於-70℃冰箱。
2. DNA萃取:
利用 CTAB的方法(Doyle and Doyle, 1987)進行 total genomic DNA萃取。
其步驟如下：
(1)取保存於-70℃狀態下的葉片組織，置於已加入液態氮之研缽內，研磨至
粉末狀，連同液態氮一起倒入離心管，將管子放置於乾冰上，等液態氮蒸
發以備用。
(2)取離心管內盛 5-10 mg 的植物粉末，加入10 ml 65℃之 3X CTAB與 40 ml
0.4% ß- mercaptoethanol 的混合液，以攪拌匙快速將粉末與緩衝液混合均
勻，置於 65°C 水浴中反應 30 分鐘，在反應過程中每 5~10 分鐘搖晃離心
管一次，使反應完全。 - 17 -
(3)將萃取液倒入離心管中，加入10 ml chloroform / isoamyl alcohol (24:1)，
上下倒轉 50-100 次，充分混合去除脂質及蛋白質。
(4)在室溫下，於桌上型離心機 8,000 rpm，離心 10 分鐘。可將植物殘渣與脂
質、蛋白質，離心至離心管底部。
(5)取上清液至一新的離心管。
(6)重複3-5 步驟，共三次。
(7)加10 ml isopropanol，均勻混合後，置於-20°C冰箱30 分鐘至 24 小時，
使DNA 沉降。
(8)以13,000 rpm 4°C 下，離心 10 分鐘，倒掉上清液，將離心管倒扣於鐵架
上20-30 分鐘，使isopropanol 完全揮發。
(9)將沉降之DNA溶解於 500 ml TE buffer，並轉置於1.5 ml小離心管中，加
入2 ml RNase 放入 37°C水浴作用 30 分鐘，以去除 RNA。
(10)加入500 ml NH4OAc (3M, PH = 7.4)以除去蛋白質。
(11)再加入 500 ml isopropanol。同步驟8，沉降析出 DNA。
(12)以13,000 rpm 4°C下，離心10 分鐘，倒掉上清液。
(13)加入70%酒精，輕彈離心管使沉澱物飄起，再以13000 rpm 4°C 下、離
心2-3 分鐘，將鹽類洗去。
(14)去上清液取沉澱物，倒置於鐵架上10-20 分鐘，等沉澱物內酒精揮發殆
盡。
(15)加入200 ml TE buffer，溶解得genomic DNA。
3. DNA的定量：
利用不同已知濃度的l DNA marker (Promega)，定量所萃取之genomic
DNA，並以TE 溶液將DNA 稀釋為2 ng / ml後，存於-20°C冰箱以備用。 - 18 -
二、實驗方法
實驗分為兩大部分，首先採用 RAPD 指紋技術檢測大安水蓑衣的遺傳變
異；之後定序葉綠體 DNA 介於atpB 及 rbcL 基因間的非轉譯區間序列，進行
相關分析。
1. RAPD指紋分析：
利用UBC商業合成引子 101-150號，複製位於 genomic DNA 上不同的基因
座。RAPD每管共25 ml,包含 6.3 ml DNA (2 ng / ml), 2.5 ml 10X PCR緩衝溶
液、2.5 ml dNTP (8 mM)、濃度 2 pmole 的 primer 0.33 ml、2.5ml MgCl2 (10
mM)、0.5ml的聚合酵素(Taq polymerse, Promega)及 10.37ml的無菌水。並加
入20 ml 礦物油，防止溶液於反應過程中受熱蒸發。其反應條件設為:
(a)92°C，15秒，利用高溫使 DNA 雙股打開(denaturation)。
(b)36°C，20秒，使primer 與模板DNA黏合(annealing)。
(c)72°C，60秒，進行DNA 延伸反應(extension)。
(d)重覆進行(a)-(c)步驟35 個循環。
(e)72°C 作用 10 分鐘後，保存於4°C。
RAPD產物在 2%之 NuSieve 3:1瓊膠(FMC Bio Products)上電泳後，以
ethidium bromide染色，並以Polaroid 667底片感光，並選用的合適Size marker
(Bio100 DNA Ladder of 100bp- 3kbp, PROtech)作為標準，判斷片段大小。
後依據照片上條帶的有無將其紀錄成表，其中 1 表有條帶，0 表無條帶。
RAPD DATA 分析：
A.族群遺傳分析
(1)先利用 AMOVA-PREP 軟體(version 1.01; Miller, 1998)將條帶紀錄表轉換
成資料矩陣，而後使用AMOVA versus 1.55 (Excoffier, 1993)軟體，測試
族群間及地理區間的分化程度，計算出ΦCT、ΦST、ΦSC值，其中ΦCT - 19 -
為地理區間的分化程度，ΦST為族群間的分化程度，ΦSC為為地理區內
族群間的分化程度。
(2)以Tfpga 1.3 (Miller, 1997)軟體計算族群間的遺傳距離(genetic
distance)，並構築族群的樹狀圖。
(3)以 DnaSP 3.0 (Rozas and Rozas, 1999)軟體計算族群間分化程度指數(Fst)
及族群間基因交流值(Nm)。
B.UPGMA樹狀圖
(1)以TREECON version 1.3b (Van de Peer, 1997)套裝軟體進行分析利用
UPGMA (unweighted pair-group method using arithmetic averages)原理構
築出演化樹狀圖。
(2)利用重複選取的原理，進行 bootstrap 1000 次分析(Felsenstein, 1985)，測
驗樹狀圖分群之可信度，依據 Hillis and Bull (1993)以電腦亂數分析，若
bootstrap 數值大於70%則往往具大於 95%的可信度。
C.主成份分析法
根據 Nei and Li (1979)所提出的公式：Sxy = 2 mxy / (mx + my)來估算兩兩個
體間的相似指數(similarity index)，其中mxy表示個體 x 和個體 y在 RAPD
指紋技術中共同擁有的條帶，使用 NTSYS-PC (version 1.8, Rohlf, 1993)套
裝軟體進行主成份分析，可得到一立體空間分布圖來顯示大安水蓑衣個體
間的關連。
2. 葉綠體DNA的非轉譯區間序列：
A.PCR (Polymerase Chain Reaction)
利用萬用引子(universal primer)（表二）增值擴大葉綠體 DNA 介於 atpB及
rbcL 基因間的 noncoding spacer (Chiang et al., 1998)，以 Taq polymerase 在
溫度循環器上複製所欲片段。在總體積100 ml的反應液中加入 0.5 ml聚合
酵素(Taq polymerase)，10 ml 10X PCR 緩衝溶液，10 ml 的 dNTP (8 mM)，濃
度2 pmole的Primers各10 ml ，10 ml的MgCl2 (10 mM) ，最後加入10 ml DNA - 20 -
(2 ng / ml)，並以無菌水補足 100 ml。反應在溫度循環機進行，共進行31 個
循環，每個循環流程為：92°C，45 秒，將 DNA 的雙股變性打開
(denaturation)；53°C，1 分15 秒，使 DNA與引子結合(annealing)；72°C，
1 分30秒，進行 DNA延伸反應(extension)；最後在 72°C 作用 10 分鐘，反
應完成後，溫度循環機維持在 4°C。取 5 ml的 PCR 產物加上 1 ml 6倍的染
色溶液，在1%瓊酯凝膠(agarose gel)中以 100伏特電壓跑電泳約30 分鐘，
經過溴化乙啶螢光染劑(EtBr)處理後，配合所選用的DNA ladder當標幟
(Bio100 DNA Ladder of 100bp- 3kbp, PROtech)，在紫外線燈台下拍照。
B.純化
DNA 聚合酵素反應(PCR)的產物有時所含的片段並不只有一段，而且有許
多離子、dNTP、引子存在，所以必須經過純化。當 PCR 產物不只一段或
不乾淨時，先把所得的PCR 產物放在1%瓊酯凝膠，以 1X TAE的緩衝液，
以70 伏特電壓進行電泳 30 分鐘，經溴化乙啶螢光染劑染色後，在紫外光
燈台下將含有所要DNA 的膠切下，以 Agarose Gel DNA Extraction Kit
(Viogene)純化。
C.T-A cloning
(1)DNA 分子的連接(ligation)
將純化後之PCR產物，取2 ml置於 200 ml eppendorf 加 5 ml 2x ligation
buffer，1 ml ATP，1 ml T4 DNA ligase 及 1 ml載體 DNA (pGEM®
-T Easy
Vector DNA) (Promega, Cat. #A1360)，在 4℃水浴中反應 16 小時，使 PCR
產物連結至載體上。
(2)轉型作用(transformation)
a.製備勝任細胞(competent cell)
從培養12 至16 小時之大腸桿菌菌液中，吸取 500 ml至含30 ml LB的錐
形瓶中，於37°C shaker 培養2 小時。隨後取出 25 ml菌液加入預先冷卻的 - 21 -
離心管中，於4°C下以4,000 rpm離心10 分鐘，倒掉上清液，再加入 20 ml
4°C的50 mM CaCl2 solution，輕搖至沉澱菌種溶解，冰浴 30 分鐘以上，
使大腸桿菌活化、沉澱。之後再於 4°C下以4,000 rpm離心10 分鐘，倒掉
上清液，再加入 4 ml CaCl2 solution，輕搖至沉澱菌種溶解，並置於 4°C冰
浴中，以備進行質體轉殖用。
b.轉型作用(transformation)
取200 ml已活化之菌液加入 5 ml與 PCR 產物連接好之載體溶液，均勻混
合後冰浴 40分鐘，接著放入 42℃水浴，進行 heat shock 1 分 30 秒後，迅
速投入冰水中，使載體進入大腸桿菌中並待塗碟用。
c.塗碟
取出含有 ampicillin (50 mg / ml)的 LB平板培養基，塗上20 ml X-gal (50 mg
/ ml)與5 ml IPTG (100 mM)，靜置30 分鐘待藥品吸收，將經過轉型之勝任
細胞以100 ml / plate 的量均勻塗抹於 LB agar 表面，待菌液乾後，置於 37
℃培養 12 至16 小時。
D.萃取質體DNA(plasmid DNA)
a.養菌
將經過培養並呈白色的菌落轉接到含 50 mg/ml ampicillin 之 5 ml LB溶液
中，於37℃培養12 至16 小時，以備抽取質體 DNA。
b.萃取質體DNA
取2 ml 培養 12 至16 小時之菌液，5,000 rpm離心 5 分鐘後，倒棄上層液，
加入 100 ml預冷之 solutionⅠ(50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 10
mM EDTA) ，震盪後靜置室溫5分鐘。接著加200 ml solutionⅡ(0.2 N NaOH,
1% SDS)，上下翻轉並置於冰上5 分鐘，加入 150 ml冷卻的 solutionⅢ(3 M
KOAc, pH 4.8)，混合後冰浴 5 分鐘，接著以13,000 rpm離心5 分鐘，吸取
上清液加入800 ml 95%酒精，混合後靜置 5 分鐘，以 13,000 rpm離心 5 分
鐘，倒棄酒精並風乾後，加入 50 ml RNase / TE buffer (10 mg/ml)，輕拍混 - 22 -
合後保存於-20℃。
E.DNA 定序
DNA 定序是以雙去氧核甘鏈停止法(dideoxynucleotide chain termination,
Sanger et al., 1977)以³ ² P-dATP做標記，定序出cpDNA 位於 atpB-rbcL 基因
間的 noncoding spacer。依據 PCR的反應原理進行反應，共進行 29 個循環，
每個循環流程為：95°C，30秒，將 DNA 的雙股變性打開(denaturation)；
57°C，30 秒，使DNA與引子結合(annealing)；70°C，1 分，進行DNA 延
伸反應(extension)；所有循環完成後，加入3 ml stop solution 停止反應。反
應後的產物在 6%的polyacrylamide-8M urea gel 上進行電泳分析，完成後將
膠轉附在 3M濾紙上，再將膠片烘乾，用 X-ray film 感光 48-72 小時後，沖
片，判讀 DNA 序列。
核酸序列自動定序由成功大學醫院病理部暨病理研究中心完成
(ABI PRISMTM 337 DNA Sequencer, Perkin-Elmer; ABI BigDye Terminator
Cycle Sequencing Kit, Perkin-Elmer)
F.DNA 序列分析(Sequence analysis)與親緣分析(phylogenetic analysis)
a.將定序所得 DNA序列輸入電腦，DNA 分子序列的資料以 Clustal X 1.81 程
式(Thompson et al., 1997)完成比對及排列(alignment)後，加以人工手動調
整。利用網際網路將所得大安水蓑衣 DNA序列上傳至 GCG (Genetics
computer Group, Version 10.0, Madison, Wisconsin)基因資料庫中，以 FASTA
程式進行比對搜尋，確定定序所得序列是 Chloroplast DNA atpB-rbcL 基因
間的noncoding spacer片段。
b.使用 MEGA 2.0 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 2.0)
(Kumar et al. 2001)套裝軟體比較彼此間鹼基對替換(transition；兩個嘌呤或
嘧啶間的突變，A/G 或T/C突變)及鹼基對顛換(transversion；嘌呤與嘧啶間
的突變，T.C/A.G突變)的發生頻率及比值，來計算大安水蓑衣序列彼此的 - 23 -
變化，並計算出全部基對取代數目(K, total nucleotide substitutions)，即每個
位置的鹼基對替換及鹼基對顛換的發生頻率。
c.利用 DnaSP version 3.0 (Rozas and Rozas, 1999)計算族群內、族群間及地理
區間的遺傳歧異度(genetic diversity)，以 haplotype diversity (h) (Nei and
Tajima, 1983)和nucleotide diversity (?)來量化顯示族群的遺傳歧異度。
d.使用TREECON v1.3b (Van de Peer, 1997)套裝軟體以 Kimura (1980)雙參數
模式(two-parameter model)的方法計算鹼基替代率及遺傳距離軟體進行分
析，利用聚類分析法(neighbor- joining method)原理(Saitou and Nei, 1987)構
築出大安水蓑衣所有個體的演化樹狀圖。NJ tree 中每一個 group之可信度
利用不加權重、重複一千次的 bootstrap (Felsenstein, 1985)分析檢測；
bootstrap 數值大於0.7相當於統計學上95%信心水準支持(Hillis and Bull,
1993)。同時亦利用 MEGA v2.0 (Kumar et al., 2001)軟體計算兩兩比較
(pairwise comparison) DNA 各單型(haplotype)間的突變數，所得數據以
MINSPNET 軟體(Excoffier and Smouse, 1994)建構親緣網狀圖 minimum
spanning network (Excoffier et al., 1992)，藉以追溯 haplotypes間的親緣關係
與演化歷史。
e.最小遺傳重組事件(minimum recombination events)、中性測驗(neutrality test)
及評估族群間及地理區間的基因交流(Nm)程度，均利用 DnaSP Version 3.0
(Rozas and Rozas, 1999)進行運算；其中Nm值表示每個世代族群間遷徙個
體數，此值可用來間接評估基因交流的大小(Slatkin, 1985)。若 Nm值等於
1，表示在地區性族群間每一個世代，有一個個體交流，足以防止藉由個別
族群因基因漂變所產生的遺傳分化。因此，當 Nm 值大於 1，即代表族群間
會有較強基因交流。也根據FST = 1 / (1 + 2Nm)的公式，估計遺傳分化程度，
其中N表示族群中有效族群量，m 表示個體遷徙速率。FST是族群間遺傳分
化指數，主要是判斷族群間遺傳分化(genetic differentiation)的情形，若 FST
﹤0.05，則代表族群間幾乎沒有遺傳分化，若 0.05﹤FST ﹤0.15，則表示族
群間的分化程度低等，若0.15﹤FST ﹤0.25，代表族群間屬中度分化，若 - 24 -
FST ﹥0.25時，表示族群間分化程度非常高(Wright, 1978)。同時，測試 Nm
值與地理距離間的相關，用以測驗是否符合Isolation by distance之模式，
並以 SAS統計程式中之F test 測試其可信度。最後以D* statistic測試分子
序列是呈現中性(Fu and Li, 1993)。
f.利用軟體Geo-Dis (Posada et al., 2000.)檢測 minimum spanning network 中地
理形式與 clade (或haplotype)間的關係，其主要運算出：clade distance (Dc
值)與nested-clade distance (Dn 值)，其中Dc 值表示一clade 內地理分布的
距離，而 Dn 值表示一clade 與上一階層(next higher level)地理分布中心的
距離。將 Dc、Dn 值配合檢索表(Templeton et al., 1995)推估族群間過去所經
歷的歷史事件。 - 25 -
第參章 結果
一、RAPD分子指紋
在實驗中共使用 50 個引子，並利用 PCR 原理隨機放大基因座間片段，所
採用的引子中有 15 個引子（表三）顯現出個體間的遺傳變異，根據電泳後照
片結果（如：圖四）將基因座(locus)的有無轉換成 1 與 0，其中1 表 locus 的存
在，0 表此locus不存在以，結果共得 158 個在不同個體間具變異的電泳條帶
（表三）。從條帶的分布情形，約略可看出大安水蓑衣個體被分為三群，採集
自宜蘭頭城的個體明顯自成一群，在台中大安的個體也群聚為一群，但清水和
龍井的個體則無法分辨，至於宜蘭頭城的個體則擁有較多的變異，與西台灣的
族群差異頗大。
根據條帶記錄表，先以AMOVA-PREP軟體轉換成資料矩陣後，利用
AMOVA 軟體分析，得到階層性的Φ值（表四），在地理區間ΦCT = 0.934 (P =
0.048)，在族群間ΦST = 0.945 (P < 0.001)，在同一地理區內的不同族群間ΦSC =
0.169 (P < 0.001)；而在各個族群間的ΦST值，宜蘭頭城和西台灣的大安水蓑衣
族群分化程度ΦST值大約在 0.97 (P < 0.001)，即宜蘭頭城和西台灣的大安水蓑
衣族群已有高度分化，若再繼續分析西台灣的族群，在清水、龍井在兩個地點
的族群，其分化程度介於 0.001~0.66，差距頗大，表示某些族群間有分化但不
明顯，至於大安的族群與其它西部族群分化程度ΦST值介於0.80~0.84，和宜蘭
頭城一樣為擁有高度分化的一群，而所有族群間的分化程度ΦST = 0.945 (P <
0.001)，故整體來說在大安水蓑衣的族群間，確實存在著高度分化。
同時利用 TFPGA軟體計算各族群間的遺傳距離(genetic distance)，若值越
大表示兩族群擁有較多的遺傳變異；並根據遺傳距離，以族群為單位構築遺傳
距離樹狀圖（圖五），在圖中宜蘭頭城的族群一開始便獨立出來，且擁有極大
的遺傳距離，更進一步顯現宜蘭頭城族群和西台灣族群間擁有明顯的遺傳分
化。 - 26 -
以DnaSP 軟體計算族群間遺傳分化指數(Fst)及基因交流值(Nm)，得到表
五，其中 Nm 值公式為Fst = 1 / (1 + 4Nm)，表示在一個世代內，兩族群間有多
少個體能夠交換遺傳物質。就大安水蓑衣而言，即在一個世代間，兩族群間能
有多少個體能將花粉傳播給另一個族群，當 Nm值 ≧ 1，即足以防止個別族
群因基因漂變所產生的遺傳分化。根據表五，宜蘭頭城的族群與西部族群間
Nm 值甚小，均在 0.01左右，而 Fst值從0.96 到 0.97，顯示頭城與其他族群具
有高度的遺傳分化，而在西台灣的大安族群其與龍井、清水族群間遺傳分化亦
相當顯著，也擁有較低的 Nm 值(0.04-0.07)和較高的 Fst值(0.77-0.87)，但在清
水和龍井兩地之間出現例外，兩族群擁有較高的 Nm 值(0.13-2.44)（最高的 Nm
值：2.44，出現在 CS-1 和LC-2 兩族群間）和較低的 Fst值(0.11-0.66)，顯示在
清水和龍井的族群間尚可能存有基因交流。
以TREECON v1.3b 軟體進行分析，利用其中 UPGMA (unweighted
pair-group method using arithmetic averages)原理構築出演化樹狀圖（圖六），在
演化樹狀圖中可明顯地看出所有的大安水蓑衣個體按照東台灣和西台灣二大
地理區分群，其中西台灣這個大群又可再分為大安和清水+龍井這兩小群，每
個分群均依照棲地分布 ，但在清水 、龍井兩地間有交雜的現象，CS-1-02, CS-2-01,
CS-2-02, CS-2-03 和CS-2-04與龍井族群的個體，分布在同一個支系中，顯示
清水、龍井棲地間的某些個體，其遺傳組成可能頗為相似，導致在演化樹狀圖
中被歸為一群，相對於清水、龍井個體在支系中交雜的現象，東西兩大地理支
系，個體各自成群，且分支長度(branch length)頗長，顯示東西兩大地理支系其
個體在遺傳組成上可能已有明顯差異；而在演化樹狀圖中，每個分支上所出現
的數字為 bootstrap 數值，其以重複選取的原理，進行bootstrap 1000 次分析，
測驗演化樹狀圖之分群的可信度，若 bootstrap 數值大於 70%，則表示此分枝
往往具有大於 95%的可信度，一開始分群的支系（頭城、大安、清水＋龍井這
三個支系）都擁有極高bootstrap數值(100%)，表示其分群的可信度相當高。
使用 NTSYS-PC套裝軟體其根據Nei and Li (1979)所提出的公式：Sxy = 2
mxy / (mx + my)其中mxy表示個體x和個體y在RAPD指紋技術中共同擁有的條 - 27 -
帶，來估算兩兩個體間的相似指數(similarity index)進行主成份分析，得到一立
體空間分布圖（圖七）可顯示大安水蓑衣個體間的關連，立體空間分布圖所得
結果和UPGMA 演化樹狀圖相似，一樣可見到頭城、大安、清水＋龍井的分群
型式，從立體空間分布圖尚發現在頭城族群間內的個體彼此距離較遠，不像大
安或清水＋龍井來地緊密，這表示在頭城其族群可能比大安或清水＋龍井的族
群擁有更多的族群內遺傳變異。 - 28 -
二.葉綠體 DNA atpB-rbcL noncoding spacer片段
利用atpB-1 和rbcL-1 引子(Chiang et al., 1998)（表二）可以成功地以 PCR
技術擴增大安水蓑衣葉綠體 DNA 介於 atpB及 rbcL 基因間的noncoding spacer
片段，實驗共完成東部及西部八個族群 70 個樣本，其序列長度介於
817-830 鹼基對，將所得序列上傳至GCG 基因資料庫中，利用 FASTA 程式
進行比對搜尋，確認定序所得序列均為葉綠體 DNA atpB-rbcL 基因間的
noncoding spacer 片段；並使用軟體 Clustal X 將序列兩兩相互比對排列
(alignment)後，完成 DNA 序列之矩陣，共有 52 個變異位置(6.1%)，
其中只有 4 個變異(0.47%)具有親緣系統訊息。圖八為大安水蓑衣各族
群葉綠體 DNA 之atpB及rbcL 基因間的非轉譯區間的代表序列。
在大安水蓑衣所有個體之葉綠體DNA位於atpB及rbcL基因間非轉譯區
間序列的核? 酸平均組成為：腺嘌呤(A: adenine)佔 36.4%，胸腺嘧啶
(T: thymine)佔 32.8%，鳥糞嘌呤(G: guanine)佔 14.4%，胞嘧啶(C:
cytosine)佔 16.4%；顯示此段序列是以 A、T 為主要組成(AT-rich)，
佔所有鹼基組成約 70%。MEGA 軟體也同時比較各序列間鹼基對替
換(transition)及鹼基對顛換(transversion)發生的比值，結果顯示大安
水蓑衣族群間 transition / transversion 的平均值為 1.1，此值大於 Li
(1997)所提出之期望值 0.5，顯示此段基因仍在持續演化中。
利用 DnaSP 程式進行各族群之核? 酸歧異度(nucleotide
diversity, ?)的計算(表六)。所有個體的核? 酸歧異度(?)為 0.00343 ±
0.00041，而頭城族群的核? 酸歧異度(?)為 0.00647 ± 0.00128 大於西部
族群的核? 酸歧異度(?) 0.00237 ± 0.00031。在 70 個樣本中，共發現
33 個 haplotypes，其中 haplotype 8 出現在 24 個體分屬龍井、清水和
大安族群，為最大的 haplotype (34.3%)，在西部族群的 60 個個體共
有 24 個 haplotypes，而在宜蘭頭城的 10 個個體中分屬 9 個
haplotypes，具有頗高的歧異度 haplotype diversity (h)：0.978 ± 0.054 - 29 -
大於西部族群的 haplotype diversity (h)：0.827 ± 0.046，從表六可確認
宜蘭頭城其族群內遺傳變異大於西部族群，這與利用 RAPD 指紋技術
得到的立體空間分布圖所推論之結果相似，而在西部的七個族群，
以大安族群擁有最高的核? 酸歧異度(0.00263 ± 0.00039)和 haplotype
diversity (0.911 ± 0.054)。
使用 TREECON v1.3b軟體進行分析計算大安水蓑衣葉綠體 DNA
atpB-rbcL noncoding spacer 序列的變異，並以 Kimura (1980)雙參數模
式計算出遺傳距離，根據此一遺傳距離利用聚類分析法(neighbor
joining method)建構出親緣演化樹狀圖（圖九）。在樹狀圖中，以宜
蘭頭城其中一個體做為外群(outgroup)，可將大安水蓑衣明顯地分為
東西地理區兩大群，與 RAPD 資料利用UPGMA原理構築的演化樹狀圖
大致上相似，但原本呈現單一群聚(monophyly)的大安族群，在
cpDNA 資料所構築的親緣演化樹狀圖，分散在清水、龍井的族群中，
也就聚在一起，但並未顯現地理族群各自群聚的型式；在樹狀圖右
側顯示 2-1~2-6, 3-1 和3-2 表示為各個不同階層的 clade，將各 clade 所包含
的個體數與分布族群整理成表七，而在圖三中各大安水蓑衣棲地旁的圓餅
圖，則表示各地點其 clade 的組成比例。
以DnaSP 軟體計算族群間的遺傳分化指數(Fst)及基因交流值(Nm)，得到表
八，與利用RAPD 資料所估算的結果有類似的型式，宜蘭頭城的族群與西部
的族群其 Nm 值甚小從0.29 到0.52，而 Fst值從 0.49到 0.63，顯示頭城與其他
地點具有高度的遺傳分化，而在西台灣的龍井、清水、大安族群間，除 CS-1
族群與其他族群有顯著分化(Fst值從 0.30-0.63)，可能是因為其樣本數過小，只
有2 個樣本導致。因此扣除 CS-1 族群後，在西台灣各族群間遺傳分化則不顯
著，其Nm 值從 5.74-121.17 而 Fst值從0.004-0.10，顯示西台灣的族群清水、
龍井和大安間可能存有基因交流。 - 30 -
三、大安水蓑衣的親緣地理
利用 MEGA v2.0 軟體，比較(pairwise comparison)大安水蓑衣葉綠
體 DNA 各單型(haplotype)間的突變數，再使用 MINSPENT 軟體(Excoffer
and Smouse,1994)分析，將近緣的 haplotype彼此連接，進一步形成高階的
clades，構築出親緣網狀圖 minimum spanning network（圖十），藉以追溯各
haplotype 間的親緣關係與演化歷史，來重建大安水蓑衣的親緣地理型式。
其依據兩項原則來探討最有可能的演化路徑：一、新的 haplotype 是從古老
的haplotype衍生而來。二、若缺乏基因交流，則新突變會被侷限在原有的族
群內。配合中性學派的論點，認為在 nested clade 圖中內部的clades (interior
clades)比尖端的 clades (tip clades)較為古老；因此檢視圖十位於親緣網狀圖中
心位置的 haplotype 6 及haplotype 18 可能為大安水蓑衣葉綠體 DNA 中較為古
老的 haplotype。
從大安水蓑衣的親緣網狀圖，發現宜蘭頭城族群的 haplotypes 各自相連，
形成 clade 3-2 = {[2-5 = (1-11 + 1-12)] + [2-6 = (1-13 + 1-14)]}，且在clade 3-2 中
並未發現任何西部族群的 haplotypes，顯示宜蘭頭城族群與西部族群可能長時
間缺乏基因交流，使得東部和西部的族群因突變而形成的新haplotype 被侷限
在各自的族群內。
西部族群的haplotypes相連所形成的 clade 3-1 = {[2-1 = (1-1 + 1-2 + 1-3 +
1-4)] + [2-2 = (1-5 + 1-6)] + [ 2-3 = (1-7 + 1-8)] + [2-4 = (1-9 + 1-10)] }無法與地
理分布呈現相關，即龍井、清水、大安族群並未像頭城族群形成單一族群群聚
的現象，而是散佈在的西部各個clade 中，可參照表七，了解各clade 的族群組
成；亦即表示在大安、清水、龍井各族群所形成的新haplotype，可能因族群間
的基因交流而出現在各個族群。 - 31 -
第肆章 討論
一、大安水蓑衣的遺傳變異
在大安水蓑衣葉綠體 DNA atpB-rbcL noncoding spacer片段，所有個體
的核? 酸歧異度為 0.00343 ± 0.00041，haplotype diversi ty (h) = 0.870
± 0.036 與其他瀕危物種比較，如：香杉(Cunninghamia konishii) (Lu et al., 2001)
其葉綠體 DNA ? 酸歧異度為 0.01018 ± 0.00263 及台東蘇鐵(Cycas
taitungensis) (Huang et al., 2001)其葉綠體DNA ? 酸歧異度為 0.01268 ±
0.07749，haplotype diversity (h) = 0.998 ± 0.002，可以看出大安水蓑衣明
顯低於其他瀕危物
